食管癌化療抗性的分子機制

許麗艷，衡晶華，李恩民

目前，治療食管癌的化療藥物主要是鉑類和氟尿嘧啶類。在患者一般狀況較好的情況下，也可使用紫杉醇或阿霉素等[1]。不同的化療藥物有不同的作用機理。順鉑(Cisplatin，DDP)通過與DNA分子中的嘌呤堿基上的N7反應，形成加合物，破壞細胞DNA的結構，干擾DNA修復，誘導癌細胞凋亡[2]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)的細胞毒性機制歸因于5-FU誤摻入RNA和DNA分子中，以及對胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)的抑制。5-FU在細胞內轉化為幾種活性代謝物：氟脫氧尿苷一磷酸酯(fluorodeoxyuridine monophosphate，FdUMP)、氟脫氧尿苷三磷酸(fluorodeoxyuridine triphosphate，FdUTP)和氟尿嘧啶三磷酸(fluorouridine triphosphate，FUTP)，它們均可破壞RNA和DNA的合成，以及抑制TS。5-FU分解代謝的限速酶是二氫嘧啶脫氫酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)，可將5-FU轉化為二氫氟尿嘧啶(dihydrofluorouracil，DHFU)[3]。紫杉醇通過促進微管蛋白的聚合，阻止其解聚，發揮穩定微管的作用，抑制細胞微管的動態重組，將細胞周期阻滯于G2/M期，阻礙細胞分裂，誘發細胞死亡[4]。然而，化療藥治療食管癌會產生各種耐藥，導致對藥物的應答率降低。本文從靶前耐藥、靶上耐藥和靶后耐藥等不同角度，闡述細胞對DDP、5-FU以及紫杉醇的抗性機制。

1 靶前耐藥

ABC(ATP binding cassette)轉運蛋白家族，主要包括ABCB1基因編碼的MDR1(multidrug resistance 1)，又稱P-糖蛋白或P-gp(P-glycoprotein)，以及MRP1(multidrug resistance associated protein 1)和ABCG2(ATP-binding cassette subfamily G member 2)等[5]。ABC家族主要通過增強藥物外排，降低細胞核內DDP濃度，導致耐藥。SRPX2基因和FZD-7基因所編碼蛋白均還可通過Wnt/β-catenin信號通路促進MDR1表達，促進食管鱗狀細胞癌(ESCC)細胞的增殖和侵襲轉移[6-7]。換言之，通過抑制MDR1可以逆轉DDP抗性。例如YB-1(Y-box-binding protein 1)可抑制MDR1的轉錄，增強DDP誘導的EC109和TE-1細胞的細胞毒作用[8]；恩替司他通過抑制Src/Mcl-1/MDR1信號軸，顯著抑制DDP耐藥小鼠的腫瘤生長[9]。從中草藥“漢防己”中分離出來的漢防己堿(tetrandrine，TET)可抑制MDR1的表達和活性，干預耐藥的發生[10]。另外，在TE-5R內發現DPD過表達導致5-FU的快速降解，DPD抑制劑吉美拉西可顯著增加TE-5R細胞內5-FU濃度，減弱5-FU耐藥性[11]。THUMPD2基因下調表達引起藥物外排增多，進而導致DDP和5-FU抵抗[12]。相關情況見圖1，ABC蛋白家族促進藥物外排，降低核內藥物濃度。

圖1 靶前耐藥模式圖

2 靶上耐藥

2.1 DNA損傷修復介導DDP抗性

如果DNA損傷發生在有絲分裂前，并且無法修復，就會誘發細胞凋亡。因此，DNA損傷修復(DNA damage repair，DDR)是腫瘤細胞逃避因化療藥物毒性引起細胞死亡的重要的耐藥機制。

2.1.1 DNA損傷修復途徑損傷修復方式包括堿基切除修復(base excision repair，BER)、錯配修復(mismatch repair，MMR)、同源重組(Homologous Recombination，HR)、非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)等。①BER:鉑類化合物誘導細胞產生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，可導致脂質、蛋白質、胞核DNA和線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)損傷。其中，最穩定且有害的ROS修飾產物之一是8-羥基鳥嘌呤(8-Hydroxyguanine，8-oxoG)，該損傷修復通過BER進行。其中，hOGG1-1a(a-hOGG1)主要修復核DNA損傷，hOGG1-2a(b-hOGG1)主要修復mtDNA損傷，介導DDP抗性[13]。②MMR:XPC是一種重要的DNA損傷識別蛋白，它不僅參與核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)，還參與MMR和雙鏈斷裂修復途徑[14]。③HR修復:增強細胞損傷修復能力的BRCA1作為HR系統的關鍵功能蛋白，可以通過與BARD1形成異源二聚體參與DDR。整合素α-5通過粘著斑激酶FAK激活PI3K/AKT信號通路，作用于BARD1，激活DDR，抗細胞凋亡，介導DDP耐藥[15]。④NHEJ修復：DNA依賴的蛋白激酶全酶(Ku70、Ku80和DNA-PKcs)是NHEJ的關鍵啟動酶。HOXB7使Ku70、Ku80和DNA-PKcs表達上調，將細胞周期阻滯于S期，產生DDP抗性[16]。

2.1.2 ATM和ATRATM(ataxia-telangiectasia mutated)和ATR(ataxia telangiectasia and Rad3-related)的激活對于DDR和維持基因組穩定性至關重要，抑制ATM或ATR被認為是一種很有前景的化療增敏策略。E2F1激活miR-26b的轉錄，其與ATM和RB基因的3UTR相互作用，下調ATM和RB的表達，增強DDP對食管癌化療的敏感作用[17]。STAT3對于有效修復受損的DNA也是必不可少的。ATR的阻斷劑VE-822與DDP的聯合作用顯著抑制了食管癌KYSE450和KYSE70細胞中p-STAT3的表達，特別是對ATM缺陷型細胞的增敏作用更加明顯，并且引起了包括Hippo通路、MAPK通路、JAK-STAT通路和PI3K-AKT通路的廣泛變化[18]。

2.1.3 其他定量蛋白質組學結合生物信息學和蛋白功能分析發現，RIP3通過上調HSP90-CDC37復合物和ERK、JNK和AKT激酶等下游信號，以一種不依賴激酶的方式調節DNA修復，導致DDP靶向耐藥[19]。

2.2 核苷酸代謝與5-FU抗性

核苷酸代謝中的關鍵酶如DPD上調表達和TS活性增加，參與了癌細胞對5-FU耐藥。ID-1與E2F1競爭結合Cdc20，激活IGF2基因表達，阻斷IGF1R(Insulin-like growth factor type 1 receptor)，間接上調TS，介導5-FU耐藥[20]。miR-338-5p與ID-1編碼基因的mRNA的3’-UTR直接相互作用，抑制ID-1表達，介導ESCC對5-FU增敏[21]。二甲雙胍誘導核苷酸代謝改變，如其中TS和胸苷激酶TK1(thymidine kinase 1)的表達增加可能導致細胞內dTTP池的增加和5-FU合成代謝物的“稀釋”，介導5-FU耐藥[22]。胰島素通過增加5-FU攝取，增加胞內游離TS、降低TS三元復合物，以及上調活性的Caspase-3的表達，促進對5-FU增敏[23]。細胞周期阻滯使胸腺嘧啶耗竭，介導5-FU增敏。REV3L表達下調通過抑制CyclinD1和Survivin的表達，誘導G1期阻滯和凋亡，增加細胞對5-FU的敏感性[24]。過表達miR-145，靶向REV3L，顯著提高5-FU抑制抗凋亡經典分子Bcl-2家族蛋白表達，提高細胞凋亡率[25]。

2.3 抑制G2/M期阻滯介導紫杉醇耐藥

在多個紫杉醇耐藥的細胞系中，發現細胞周期分布改變：G0/G1和S期細胞增多，G2/M期細胞減少[26]。5-AZ可通過誘導細胞周期相位重新分布，使耐藥ESCC細胞對紫杉醇化療重新增敏[27-28]。STMN1(Stathmin)通過促進微管解聚和/或防止微管蛋白異二聚體聚合，調節微管動力學；沉默STMN1基因表達可以通過G2/M期阻滯增加ESCC對紫杉醇的敏感性[29-30]。有關食管癌化療紫杉醇和5-FU的靶上耐藥機制見圖2，其中DNA損傷修復介導DDP抗性；TS、TK1增加胞內dTTP池，降低5-FU合成代謝物濃度，介導5-FU抗性；解除G2檢查點介導紫杉醇抗性。

圖2 靶上耐藥模式圖

3 靶后耐藥

腫瘤細胞可以通過細胞程序性死亡系統的改變對化療藥物產生抵抗，涉及腫瘤細胞本身及腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)。有關食管癌靶后耐藥相關機制見圖3，促進增殖、抑制凋亡、侵襲轉移、腫瘤細胞干性、Warburg效應、CAFs分泌因子均介導不同化療藥物耐藥。

圖3 靶后耐藥模式圖

3.1 抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、介導化療抗性

3.1.1 凋亡抑制蛋白家族介導DDP抗性凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)的抗細胞凋亡能力在化療抗性中發揮重要作用。Survivin是細胞凋亡抑制蛋白IAPs家族的成員，能夠抑制半胱天冬蛋白酶，阻斷細胞死亡[31]。miR-214-3p靶向下調Survivin和CUG-BP1表達，誘發ESCC細胞化療增敏[32]。Caspase激活因子Smac通過拮抗IAPs，促進細胞凋亡。Smac基因敲除顯著抑制DDP誘導的線粒體膜電位塌陷、Caspase激活和細胞色素c釋放所引起的細胞凋亡，導致體內外DDP耐藥[33]。XIAP(X chromosome-linked inhibitor of apoptosis)是IAPs家族的另一成員，靶向抑制Caspase 3和Caspase 9。HSP90(heat shock protein 90)抑制劑17-AAG和DDP聯用，通過抑制AKT/XIAP，激活Caspase-3，PARP降解，誘導細胞凋亡，介導DDP的增敏[34]。

3.1.2 PI3K/AKT/mTOR途徑激活介導化療抗性PI3K/AKT/mTOR信號通路在調控細胞生長、存活和凋亡等過程中發揮重要作用。AKT將BAD蛋白136絲氨酸殘基位點磷酸化，降低其與Bcl-2的親和力，導致抵抗細胞凋亡[35]。PPP2R1B基因編碼的磷酸酶PP2A可以使AKT去磷酸化，增強化療的敏感性，而miR-200C靶向抑制PPP2R1B表達，增強對DDP的抗性[36]。抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路上游負性調控因子PTEN，增強化療抗性。Cyclin B1通過PTEN/AKT途徑，抑制Bcl-2依賴的線粒體調節的內源性死亡途徑，產生抗性，且體外實驗顯示，miR-141-3p直接與PTEN的3’-UTR結合，抑制細胞凋亡，促進EC9706R細胞獲得耐藥[37,38]。mTOR介導化療抗性。PP242能抑制mTORC1和mTORC2的活性以及mTORC1依賴的PI3K/AKT的反饋激活，促進DDP誘導的細胞凋亡[39]。

3.1.3 NF-kB介導化療抗性在腫瘤細胞中，NF-κB的表達可能是影響以5-FU為主的化療的關鍵因素[40]。siRNA抑制NF-κB蛋白表達可以增強5-FU的抗細胞增殖作用[41]。p65 的siRNA抑制NF-κB的活化，提高針對5-FU的裸鼠模型的化療敏感性[42]。然而，RNAi方法作用時間短，極大地限制了其臨床應用。在ESCC和EAC中均發現，姜黃素通過抑制IkBa磷酸化，抑制NF-kB的活化，下調Bcl-2和CyclinD1，使細胞周期阻滯，增加細胞凋亡率[43-44]。

3.1.4 p38與p53以不同方式影響化療p38蛋白作為MAPK家族中的成員與誘導凋亡相關。miR-29c通過直接靶向抑制FBXO31基因表達和p38蛋白激活，在體內外誘導細胞凋亡，抑制細胞增殖，逆轉5-FU的化療耐藥性；而STAT5A直接與miR-29c啟動子結合抑制其轉錄，產生相反的效應[45]。與p38δ陽性的ESCC相比，p38δ陰性的ESCC對DDP和5-FU耐受性更強[46]。P53基因在70%的EAC中發生突變，導致化療耐藥。突變型P53基因的異位表達使P53基因缺失的細胞對APR-246敏感，而P53基因敲除或敲降降低了藥物活性。APR-246作為突變型P53復活劑在CLX和PDX模型中顯示了強大的抗腫瘤活性，并恢復了對DDP/5-FU耐藥異種移植模型的化療敏感性[47]。

3.1.5 其他靶點分子及通路lncRNA CCAT1在體內外通過調節miR-143/PLK1/BUBR1信號軸，促進細胞增殖，增強DDP耐藥性[48]。BMI1和Mel18共同抑制c-Myc，增加細胞凋亡和細胞毒性，介導對DDP的增敏[49]。在補充甲基硒酸的EAC細胞中，硒結合蛋白SELENBP1穩定過表達，導致細胞凋亡，細胞衰老和DDP細胞毒性增加[50]。在EAC細胞及小鼠模型中，Deferasirox和DFO作為鐵螯合劑有效地抑制了細胞對鐵的攝取，促進細胞內鐵的動員，降低了細胞活力和增殖，增強DDP、5-FU和阿霉素對細胞的毒性[51]。

3.2 腫瘤干細胞介導DDP抗性

腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)或腫瘤起始細胞(tumor initiating cells，TICs)在腫瘤的發生、轉移和復發中發揮主導作用，同時也可能是化療失敗的源頭。①干細胞標志物與耐藥:Nanog蛋白決定胚胎發育過程中多能內細胞團(inner cell mass，ICM)的命運，介導DDP抵抗[52]。CD271+、整合素α6bri/CD71dim和/或過表達Achaete-Scute復合物同源物2似乎至少代表一個干細胞亞群，抑制對5-FU和DDP的敏感性[53-54]。②抑制干細胞分子標志物介導化療藥物增敏：IGF2的中和抗體，通過IGF2-PI3K/AKT-miR-377-CD133信號軸，抑制腫瘤干性，增強裸鼠移植瘤對5-FU治療的敏感性[55]。塞來昔布通過抑制COX2表達，減少CSC分子標志物，使食管癌細胞對5-FU敏感[56]。低濃度的全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)與5-FU和DDP聯合使用，可促進CSCs凋亡，以及G2/M和G0/G1期細胞周期阻滯，增強DDP和5-FU的細胞毒作用[57]。③侵襲與耐藥:干細胞相關蛋白，Nanog、p63和Bmi-1，以及EMT相關蛋白，N-cadherin和纖維粘連蛋白，在P75NTR陽性組中表達水平顯著增高，對DDP的抗性也顯著增高[58]。BMP結合卵泡抑素樣蛋白FSTL1，通過典型的NFκB途徑激活和BMP途徑減弱，在ESCC的發生和轉移中發揮重要的癌蛋白的作用，介導DDP抗性[59]。染料外排亞群(side population，SP)細胞作為人食管癌干細胞(esophageal cancer stem cells，ECSCs)樣亞群的一個關鍵特征，對化療的抵抗力顯著高于大多數其他癌細胞。長期應用化療可能通過SP細胞的富集，使原本對化療敏感的食管癌產生獲得性耐藥，促進癌細胞向遠處轉移[60]。④miRNAs與耐藥或增敏:如let7、miR-134、miR-296、miR-302、miR-367和miR-470，參與干細胞功能調節，如自我更新、多能性和分化。沉默miR-455-3p使包括Wnt/β-catenin和TGF-β等多條TIC相關通路失活,減少CD90+和CD271+TIC亞群，可使ESCC細胞對DDP增敏[61]。

3.3 TME改變調控DDP抗性

化療耐藥性是一種復雜的多因素參與的過程，同癌細胞與TME之間的相互作用有關。越來越多的證據表明癌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞和ECM成分組成的TME在促進實體腫瘤對化療耐藥的發生中發揮著關鍵作用。IL-6通過激活STAT3/NF-κB信號通路，上調CXCR7的表達，介導DDP抗性[62]。涉及癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)的化療耐藥機制包括調控癌細胞與ECM相互作用的通路、CAF-ECM黏附和細胞因子或趨化因子介導的信號轉導。在腫瘤進展的早期階段，TGFβ1與其受體的胞外區結合抑制癌細胞的增殖，在晚期促進上皮向間充質轉化和轉移。CAF可通過FOXO-1/TGFβ1信號環介導DDP以及紫杉醇耐藥[63]。PAI-1作為DDP刺激CAF的旁分泌因子可以通過激活AKT/ERK，影響體外培養的食管癌細胞增殖和耐藥，并且PAI-1使caspase和γH2AX失活，降低ESCC細胞的DNA損傷和ROS水平，抑制氧化應激，以保護腫瘤細胞免受DDP的影響[64]。

3.4 侵襲轉移介導DDP抗性

激活后的SOX9通過與miR-203a啟動子結合抑制其轉錄，阻止miR-203a對PI3K/AKT/mTOR的抑制作用，促進ESCC侵襲，介導DDP抗性[65]。miR-125a-5p的過表達顯著降低STAT3和p-STAT3及其下游靶基因VEGF在ESCC細胞的蛋白水平，介導DDP增敏[66]。達沙替尼通過抑制PI3K/AKT和STAT3通路，顯著提高DDP對ESCC細胞KYSE410的Caspase的激活，促進細胞凋亡，抑制ESCC細胞侵襲和血管生成[67]。DDK3處理的EAC細胞OE33可以通過TGF-β促進血管內皮形成，對5-FU和DDP的耐藥性明顯增強[68]。miR-221直接靶向抑制DKK2激活Wnt/β-catenin通路，促進EMT，最終導致化療抵抗[69]。

3.5 代謝

在大多數情況下，癌細胞主要依賴有氧糖酵解提供能量和代謝物質。實體腫瘤組織中的缺氧狀態不僅為ESCC細胞的生長與增殖創造了獨特的環境，同時也使ESCC對包括化療在內的常規癌癥治療的反應性減弱。Warburg效應調節因子，SLC2A1又稱GLUT1，是主要的葡萄糖轉運蛋白之一，可促進糖酵解效率增加,以滿足細胞生長的需要。突變型P53的表達可促進GLUT1從細胞質到細胞表面的轉位，增加葡萄糖的攝取。PAX5編碼基因敲低可以通過PAX5-p53-SLC2A1軸促進細胞增殖，增強DDP抗性[70]。AMPK(AMP-activated protein kinase)是Warburg效應的負調節因子，其活性形式可下調能量消耗過程。水飛薊賓可以激活AMPK，逆轉Warburg表型，協同5-FU發揮抗癌作用[71]。ATP調節因子，ALC1是ATP依賴的染色質重塑酶，它通過抑制PI3K/AKT途徑，抑制糖酵解，抑制細胞生長，增強DDP對ESCC細胞的細胞毒作用[72]。RAC1的沉默抑制AKT/FOXO3a信號轉導，抑制細胞糖酵解,增敏DDP的治療[73]。磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)將葡萄糖代謝與核酸生物合成聯系起來，提供谷胱甘肽還原酶所需的NADPH，產生用于ROS解毒的GSH。丙酮酸激酶是糖酵解中的限速酶，抑制丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)，減少葡萄糖流入PPP，恢復對DDP的敏感性，導致DDP治療后細胞內ROS水平的增加[74]。YQ23作為一種新型的氧氣載體，能抑制HIF-1α的表達，進而使腫瘤表型從較多的間質狀態轉變為上皮狀態，逆轉對DDP和5-FU的抗性[75]。

受限的葡萄糖水平已被證明可以誘導細胞周期停滯，減緩細胞增殖速度，使腫瘤細胞進入靜止狀態。在缺糖條件下，糖酵解受限，二甲雙胍處理的EC109細胞的能量供應受到明顯限制，AKT磷酸化受到明顯抑制，嚴重損害了細胞的DNA修復過程[76]。二甲雙胍在體內外均能顯著抑制4EBP1和S6K1的表達，促進細胞凋亡，增強DDP的作用[77]。

4 總結

順鉑、5-FU、紫杉醇的作用部位前中后的機制有相似之處。三者靶前耐藥機制主要為膜轉運蛋白ABC家族促進藥物外排。靶上耐藥機制則因藥物本身作用部位不同而異，如順鉑與DNA損傷修復相關，5-FU與核苷酸代謝相關，紫杉醇則與G2M期相關。靶后耐藥與增殖、凋亡、腫瘤干細胞、腫瘤微環境、侵襲轉移以及代謝等相關。盡管耐藥機制令人望而生畏，但不應忽視這樣一個事實，即化療在多數情況下都是有效的，顯著延長了患者的生命，在某些情況下，還能治愈食管癌。因此，尋找化療耐藥或增敏的關鍵分子，減少化療耐藥，是現在以及未來的重點和難點。