肝局灶性結(jié)節(jié)增生患者血漿miR-21的表達(dá)及鑒別診斷價(jià)值

胡 捷， 張翔宇， 王 征*， 周 儉,2*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤外科，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所，教育部癌變與侵襲原理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032

肝臟局灶性結(jié)節(jié)增生(focal nodular hyperplasia，F(xiàn)NH)是一種常見的肝臟良性占位，是先天存在的血管畸形導(dǎo)致的肝細(xì)胞異常排列，異常排列的肝細(xì)胞被纖維板層分隔并圍繞在中心瘢痕周圍[1]。

近年來，隨著影像學(xué)技術(shù)的不斷提高及體檢的逐漸普及，F(xiàn)NH的報(bào)道有所增加，但一部分FNH病例缺乏典型的影像學(xué)表現(xiàn)，與肝腺瘤(hepatocellular adenoma, HCA)及肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)較難鑒別。FNH不是腫瘤性病變，也無惡性轉(zhuǎn)變傾向，定期隨訪即可。而HCC是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在我國(guó)惡性腫瘤中居第四位，死亡率卻居第二位[2]。根治性手術(shù)切除是治療HCC最有效的方法之一。HCA雖是一種良性肝腫瘤，但存在惡變和破裂出血的風(fēng)險(xiǎn)，因此也應(yīng)盡早手術(shù)切除。因此術(shù)前準(zhǔn)確的診斷對(duì)于手術(shù)決策具有重要意義。

FNH、HCA和HCC均可表現(xiàn)為動(dòng)脈期的強(qiáng)化，在影像學(xué)表現(xiàn)上具有一定的重疊性。臨床上通過乙肝背景及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平可鑒別大部分HCC。但是仍有約40%的HCC患者AFP陰性，這部分HCC患者通過影像學(xué)、病史與一些不典型的FNH較難鑒別。MiR-21是一種在肝癌組織中高表達(dá)的促癌miRNA[3-4]，也有研究[5-6]發(fā)現(xiàn)肝癌外周血中也高表達(dá)miR-21。本研究探討血漿miR-21在FNH病例中的表達(dá)及其對(duì)FNH、HCA和AFP陰性HCC的鑒別診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年3月至2020年8月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤外科收治的FNH患者61例、HCA患者20例、AFP陰性HCC患者142例，共223例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)接受外科手術(shù)切除；(3)具有完善的臨床病理資料；(4)所有病例術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)AFP>20 ng/mL的HCC病例；(2)術(shù)前接受過抗腫瘤治療的肝癌病例；(3)病理診斷為混合性肝癌的病例。另納入在我科體檢且未發(fā)現(xiàn)肝臟實(shí)性占位性病變、無其他惡性腫瘤病史的患者100例為對(duì)照組。所有樣本均具有完備的AFP、異常凝血酶原(des-γ-carboxy prothrombin，DCP)檢測(cè)數(shù)據(jù)，肝癌樣本具有詳細(xì)的腫瘤學(xué)特征資料。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審查(B2019-090)，所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 血漿miR-21的檢測(cè) 血漿樣本在靜脈采集血液后4 h內(nèi)離心分離，以避免溶血導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)miRNA釋放。所有樣本采用兩步離心法收集血漿：首先1 300×g離心20 min去全血中的細(xì)胞成分，然后14 000×g離心10 min去除可能殘存的細(xì)胞碎片。收集的血漿樣本與保存液(JUSBIO SCIENCES, 上海, FD05059)混合后置于-80℃深低溫冰箱保存。采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，real-time qRT-PCR)定量檢測(cè)miRNA，嚴(yán)格按照試劑盒(JUSBIO SCIENCES, 上海, HCC9655)操作說明書進(jìn)行。同時(shí)檢測(cè)血漿miR-1228的表達(dá)作為定量的內(nèi)參照[7]。

1.3 靶基因預(yù)測(cè)及信號(hào)通路分析 通過檢索miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(TargetScan，miRDB和ENCORI)，取三者交集，鑒定潛在靶基因，并通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：共納入323例，男性235例，女性88例。其中FNH患者61例，平均年齡34.9歲，77.1%的患者為單發(fā)腫塊，平均腫塊大小為3.8 cm。AFP陰性HCC患者142例，平均年齡61.1歲，單發(fā)腫瘤109例(76.8%)，平均腫瘤大小為3.9 cm，97例(68.3%)患者無微血管侵犯，中國(guó)肝癌分期(China liver cancer staging，CNLC)為Ⅰ期的110例(77.5%)，Ⅱ、Ⅲ期為32例(22.5%)。HCA患者20例，平均年齡42歲，單發(fā)腫瘤占95%，平均腫瘤大小為3.6 cm。無肝占位的對(duì)照組100例，平均年齡為55.5歲，均經(jīng)彩超檢查以排除肝臟實(shí)性占位。

表1 入組病例的基本臨床信息

2.2 血漿異常凝血酶原和miR-21的表達(dá) 結(jié)果(圖1A)顯示：DCP在AFP陰性HCC患者中的表達(dá)顯著高于其他3組，在FNH和HCA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(圖1B)顯示：血漿miR-21在對(duì)照組和FNH患者中的表達(dá)水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.103)。而HCA患者中血漿miR-21的表達(dá)顯著高于FNH患者(P<0.001，倍數(shù)差異=2.03)和對(duì)照組(P<0.001, 倍數(shù)差異=1.78); AFP陰性HCC患者血漿miR-21的表達(dá)在4類人群中最高，是FNH人群的2.43倍(P<0.001)，HCA人群的1.21倍(P=0.351)。相關(guān)性分析(圖1C)表明，血漿miR-21的表達(dá)與其他臨床病理參數(shù)無相關(guān)性。

圖1 DCP和血漿miR-21在4組患者中的表達(dá)差異

2.3 miR-21的靶基因預(yù)測(cè)及信號(hào)通路分析 結(jié)果(圖2)顯示：共鑒定出167個(gè)潛在靶基因，這些靶基因大多聚集在MAPK、Ras、TGF-β等促細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖2 miR-21的功能分析

2.4 血液學(xué)指標(biāo)鑒別FNH的效能分析 結(jié)果(表2、圖3)顯示：miR-21在區(qū)分FNH與AFP陰性HCC的AUC為0.914，特異度為92.3%，靈敏度為75.4%。而區(qū)分FNH與HCA的AUC為0.806特異度為50.8%，靈敏度為100%。進(jìn)一步按臨床治療決策分組，miR-21區(qū)分無須手術(shù)的FNH病例和需要手術(shù)的病例(HCC和HCA)AUC為0.900，特異度為75.4%，靈敏度為88.9%。以上鑒別診斷的準(zhǔn)確度均優(yōu)于DCP。因miR-21的靈敏度較高，而DCP的特異度較高，將miR-21和DCP聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高鑒別診斷的準(zhǔn)確度。

表2 血液學(xué)分子標(biāo)志物的鑒別診斷效能分析

圖3 血液學(xué)指標(biāo)鑒別FNH與AFP- HCC的ROC分析

3 討 論

FNH是發(fā)病率僅次于肝血管瘤的第二大肝臟良性占位。盡管FNH與肝硬化有相似的病理學(xué)特征改變，但FNH無腫瘤相關(guān)基因突變，不會(huì)進(jìn)展為HCC。有研究表明，F(xiàn)NH發(fā)病率為0.3%～3%，好發(fā)于年輕女性(男女比例為1：8)[8]，但FNH的發(fā)生并不依賴于激素[9]。本研究顯示，F(xiàn)NH平均年齡為34.9歲，顯著低于HCA(42.0歲)和HCC病例(61.1歲)。絕大多數(shù)FNH病例是在體檢時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，患者無特殊癥狀。

大部分FNH與HCC可通過增強(qiáng)CT或者M(jìn)RI進(jìn)行鑒別診斷，但臨床上也有一些非典型的FNH，因其內(nèi)部出現(xiàn)脂肪沉積，出血或鈣化導(dǎo)致動(dòng)脈期不均勻強(qiáng)化(與HCC類似)。同時(shí)，小于3 cm的FNH無中心瘢痕，使得其與HCC或HCA在影像學(xué)上較難鑒別。許多FNH因誤診或無法判斷性質(zhì)而選擇了手術(shù)切除或介入治療，給患者帶來不必要的手術(shù)創(chuàng)傷；而一些AFP陰性的HCC患者也會(huì)因?yàn)檎`判為FNH從而錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。因此，術(shù)前準(zhǔn)確鑒別出占位性質(zhì)，對(duì)治療方式的決策以及患者預(yù)后的改善具有重要意義。有學(xué)者[10]試圖采用肝臟彈性超聲來鑒別FHN與HCA，該研究共納入88例患者(其中65例FNH, 23例HCA)，通過肝臟彈性超聲區(qū)分2類患者的平均AUC只有0.68，準(zhǔn)確度較差無臨床實(shí)用價(jià)值。而采用肝膽特異性MRI造影劑Gd-BOPTA或Gd-EOB-DTPA可顯著提高FNH的診斷準(zhǔn)確度[11-12]，但臨床應(yīng)用常受限于造影劑昂貴、MRI預(yù)約周期較長(zhǎng)以及造影劑過敏等因素，無法常規(guī)開展。本研究基于血液學(xué)指標(biāo)miR-21來鑒別不典型FNH與AFP陰性的HCC，AUC達(dá)0.914，診斷特異度為92.3%，靈敏度為75.4%，具有低成本、檢測(cè)方便迅速等優(yōu)點(diǎn)和極高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

miR-21是一種促癌miRNA，在肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均高表達(dá)[13]。miR-21可通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT等信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的增殖[14]，是一種潛在的分子標(biāo)志物。而外周血循環(huán)miR-21在FNH和HCA病例中的表達(dá)目前尚無研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-21在FNH病例和無肝臟占位的對(duì)照人群中表達(dá)相似，在HCA患者和AFP陰性的HCC患者中表達(dá)顯著升高。信號(hào)通路分析顯示，miR-21的靶基因多集中在腫瘤相關(guān)信號(hào)通路或增殖相關(guān)通路。結(jié)果提示血漿miR-21可準(zhǔn)確地將無需手術(shù)治療的FNH和需要手術(shù)切除的HCA和AFP陰性HCC區(qū)分開來。納入的62例FNH中13例為非典型FNH(術(shù)前增強(qiáng)MRI傾向惡性腫瘤)，采用miR-21和DCP聯(lián)合指標(biāo)進(jìn)行鑒別，其中10例可獲得正確的判斷，從而避免有創(chuàng)的手術(shù)治療。

綜上所述，本研究首次探討血漿miR-21在FNH病例、HCA病例及AFP陰性HCC病例中的表達(dá)情況，為臨床肝腫瘤的鑒別及治療方式的選擇提供了新思路，但是也存在一些不足，HCA及FNH發(fā)病率相對(duì)較低，因此樣本量偏小；另外，肝癌樣本局限為乙肝背景，與國(guó)外丙肝及酒精肝引發(fā)的肝癌存在一定差別；本研究為單中心研究，僅采用了中國(guó)漢族人群作為研究對(duì)象，研究結(jié)果仍需國(guó)際多中心研究進(jìn)一步證實(shí)。