高表達(dá)CXCR4可通過乳酸脫氫酶A磷酸化誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥

祝巧良， 盧春來， 古 杰， 葛 棣

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上海 200032

肺癌已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。近年來，肺癌的病理類型譜發(fā)生了顯著變化：肺腺癌的發(fā)生率不斷上升，已超越鱗癌，成為最常見的肺癌組織學(xué)類型[1]。在肺腺癌中，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的激活突變是最常見的驅(qū)動基因突變，以吉非替尼和厄洛替尼為代表的EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)可顯著延長含EGFR敏感突變(19del、21-L858R)肺腺癌患者的無進(jìn)展生存期(progression-free-survival，PFS)[2]。但是，即使對EGFR-TKIs初治高度敏感的患者，在經(jīng)過9～11個月的中位PFS后，幾乎都不可避免地產(chǎn)生耐藥，這極大限制了其臨床治療效果[3]。目前關(guān)于EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制主要包括：靶基因的二次突變，如T790M突變[4]；EGFR旁路的持續(xù)激活，如MET擴(kuò)增[5]；表型和組織學(xué)類型的轉(zhuǎn)化，如小細(xì)胞轉(zhuǎn)化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)[6]，但仍有部分耐藥機(jī)制尚未闡明。因此，深入研究EGFR-TKIs耐藥的相關(guān)機(jī)制，制訂相應(yīng)的策略，具有重要的理論價值和臨床意義。

CXC趨化因子受體4(CXCR4)在多種腫瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。且CXCR4的高表達(dá)可顯著降低腫瘤的化療藥物敏感性、誘導(dǎo)化療耐藥[9-10]。值得注意的是，肺腺癌細(xì)胞在出現(xiàn)吉非替尼耐藥后，CXCR4的表達(dá)水平較耐藥前顯著升高[11]。但CXCR4高表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥的相關(guān)性目前仍不明確。因此，本研究旨在通過體外及體外試驗(yàn)初步探討CXCR4高表達(dá)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC9(含EGFR-19del突變的吉非替尼敏感的肺腺癌細(xì)胞)、PC9/GR(含 EGFR-19del突變的吉非替尼耐藥的肺腺癌細(xì)胞)均購于湖南豐暉生物科技有限公司；PC9細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，PC9/GR細(xì)胞按細(xì)胞說明書要求培養(yǎng)于加有2 μmol/L吉非替尼(Selleck公司)的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 RNA干擾 PC9/GR細(xì)胞對數(shù)生長期時，消化后鋪板，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染以下調(diào)胞內(nèi)CXCR4水平，轉(zhuǎn)染方法按照Lipo2000說明書。針對CXCR4的mRNA設(shè)計siRNA：siCXCR4-1的靶序列為5′-GGU ACU UUG GGA ACU UCC U-3′(F)、5′-AGG AAG UUC CCA AAG UAC C-3′(R)；si-CXCR4-2的靶序列為5′-CCU GUC CUG CUA UUG CAU U-3′(F)、5′-AAU GCA AUA GCA GGA CAG G-3′ (R)；siCXCR4-3的靶序列為5′-GUG AGU UUG AGA ACA CUG U-3′(F)、5′-ACA GUG UUC UCA AAC UCA C-3′(R)。siRNA-NC為非特異性非相關(guān)的RNA片段，作為對照組。

1.3 慢病毒感染 采用CRISPR/CAS9(漢尹生物科技有限公司)技術(shù)設(shè)計、構(gòu)建、包裝過表達(dá)ovCXCR4及對照ovCtrl的慢病毒載體，測定慢病毒滴度；2×105/孔的PC9細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，移入生物安全柜操作，按照產(chǎn)品說明書滴加慢病毒；按1∶1 000比例加入polebrene混勻；慢病毒感染24 h后換液；48 h后加入適量嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)72 h，去除未成功感染慢病毒的細(xì)胞；待細(xì)胞擴(kuò)增至長滿80%的6孔板后，消化、收集細(xì)胞。qRT-PCR、Western印跡檢測CXCR4表達(dá)情況，鑒定感染效果。

1.4 qRT-PCR和Western印跡檢測 細(xì)胞總RNA提取、qRT-PCR、細(xì)胞總蛋白提取、Western印跡檢測等步驟參照既往文獻(xiàn)[12]報道方法進(jìn)行。細(xì)胞總RNA提取、qRT-PCR：吸去培養(yǎng)液，PBS清洗1次，加入Buffer RZ裂解液裂解細(xì)胞，按細(xì)胞總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將cDNA用作RT-PCR模板，按TaKaRa熒光定量PCR試劑盒說明書配制試劑和樣品，加入20 μL反應(yīng)體系于ABI Prism 7500實(shí)時PCR儀器反應(yīng)。CXCR4引物合成于上海生工生物科技有限公司，為5′-TGT CAT CTA CAC AGT CAA CCT C-3′(F)、5′-CAA CAT AGA CCA CCT TTT CAG C-3′(R)。β-actin引物序列為5′-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3′(F)、5′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′(R)。

細(xì)胞總蛋白提取、Western印跡檢測：去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2遍，加入RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，4℃離心(13.8×g)10 min后取上清液，獲得總蛋白。BCA法測定蛋白濃度；加入SDS加樣緩沖液，100℃煮沸10 min使蛋白變性。按5～10 g樣品上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜、洗膜、二抗孵育、洗膜后，采用ECL試劑顯色發(fā)光。一抗貨號：pEGFR(#3777), EGFR(#2085), pAKT(#2965), AKT(#9272), pERK1/2(#4370), ERK1/2(#4695), Cleaved caspase 3(#9664), BAK(#6947), BCL-2(#3498), BCL-XL(#2764), 乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA，#3582)，pLDHATyr10(#8176), β-actin(#4970)均購自美國賽信通公司；CXCR4抗體(ab181020)購自英國Abcam公司。

1.5 克隆形成、CCK-8、流式細(xì)胞凋亡術(shù)

1.5.1 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按1.5×103個/孔接種到6孔板中，細(xì)胞貼壁24 h, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?轉(zhuǎn)染siRNA/加入抑制劑)經(jīng)相應(yīng)處理后持續(xù)培養(yǎng)2周，4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野中含50個以上細(xì)胞的集落，計數(shù)、求平均值并統(tǒng)計。

1.5.2 CCK-8檢測 將細(xì)胞按5×103個/孔接種到96孔板中，細(xì)胞貼壁24 h,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?轉(zhuǎn)染siRNA/加入抑制劑)經(jīng)相應(yīng)處理72 h后，進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，具體步驟按照CCK-8說明書進(jìn)行；將CCK-8試劑與無血清培養(yǎng)液進(jìn)行1∶9混合，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別于對應(yīng)孔中加入100 μL CCK-8混合液，37℃孵育1～2 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm的光密度(D)值，計算并統(tǒng)計細(xì)胞相對增殖活力。

1.5.3 流式細(xì)胞凋亡術(shù) 將細(xì)胞按4×104個/孔接種到24孔板中，細(xì)胞貼壁24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?siRNA干擾/加入抑制劑)經(jīng)相應(yīng)處理48 h后，消化、收集細(xì)胞。4℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，2次4℃離心(300×g)5 min；250 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞；根據(jù)Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(翌圣生物科技有限公司)說明書，取100 μL細(xì)胞懸液，加入流式抗體5 μL APC-Annexin Ⅴ和10 μL PE-PI，室溫避光反應(yīng)15 min，每管加入4℃預(yù)冷的PBS 400 μL終止反應(yīng)，上機(jī)并檢測[13]。

1.6 裸鼠皮下成瘤 動物研究和實(shí)驗(yàn)方案已獲得復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心批準(zhǔn)(B2021-128)，根據(jù)動物安置和護(hù)理準(zhǔn)則對動物進(jìn)行飼養(yǎng)和處理。本研究使用4～6周齡清潔級雌性裸鼠(上海杰思捷公司)，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院SPF級動物房(12 h/12 h光照/黑暗周期)。每只小鼠皮下注射2×106個細(xì)胞，荷瘤小鼠飼養(yǎng)2周后隨機(jī)分組(3只小鼠/組)：Ctrl(PBS)、Gef (gefitinib;30 mg/kg，灌胃，qd×3周)；AMD(AMD 3100; 5 mg/kg，腹腔注射，qd×4周)；AMD+Gef(AMD預(yù)處理1周，然后用Gef處理)；Oxa(oxamate ;750 mg/kg，腹腔注射，qd×4周)；Oxa+Gef(Oxa預(yù)處理1周，然后用Gef處理)。每3 d用游標(biāo)卡尺測量皮下瘤直徑，評估并統(tǒng)計。

1.7 免疫共沉淀 擴(kuò)增并收集過表達(dá)CXCR4的PC9細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)IP裂解液裂解，取上清后加入抗CXCR4抗體/IgG，4 ℃振蕩過夜，免疫復(fù)合物溶液與Protein A/G磁珠在室溫下混合孵育，洗滌，留取陰性參照、陽性參照、IP液，經(jīng)上樣、電泳、考馬斯亮藍(lán)染色后送上海維基生物科技有限公司行蛋白膠條Shotgun質(zhì)譜分析，Western印跡驗(yàn)證質(zhì)譜。具體步驟參照既往文獻(xiàn)[14]。

1.8 葡萄糖消耗量和乳酸生成量測定 將細(xì)胞按3×105個/孔接種到6孔板中，貼壁24 h；將培養(yǎng)液更換為無酚紅(賽默飛世爾科技有限公司，美國)低葡萄糖DMEM液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?siRNA干擾/加入抑制劑)經(jīng)相應(yīng)處理48 h后，從每個孔中收集50 μL培養(yǎng)液等分試樣，以950 μL蒸餾水(1∶20)稀釋。使用葡萄糖檢測試劑盒(Sigma-Aldrich)，按照產(chǎn)品說明書設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，加入顯色劑后37℃環(huán)境反應(yīng)15 min，酶標(biāo)儀測定505 nm處的各測試孔D值，計算并統(tǒng)計細(xì)胞的葡萄糖消耗量；使用乳酸檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)，按照產(chǎn)品說明書設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，加入顯色劑后37℃環(huán)境反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測定530 nm處的各測試孔D值，計算并統(tǒng)計細(xì)胞的乳酸生成量。具體步驟參照既往文獻(xiàn)[15]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)比較差異。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每項(xiàng)重復(fù)3次。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 PC9/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥性鑒定 克隆形成(圖1A)、CCK-8檢測(圖1B)結(jié)果顯示，在吉非替尼作用下，PC9/GR顯示出顯著增強(qiáng)的增殖能力；PC9/GR、PC9細(xì)胞的吉非替尼半抑制濃度IC50分別是19.15 μmol/L、0.195 μmol/L，前者明顯高于后者；在吉非替尼作用下，PC9細(xì)胞中pAKT、pERK明顯下調(diào)，而在PC9/GR細(xì)胞中無明顯下調(diào)，提示PC9/GR可顯著抵抗吉非替尼對EGFR下游通路的抑制作用(圖1C)；PC9/GR較PC9細(xì)胞存在顯著增強(qiáng)的抗凋亡能力(圖1D)；PC9細(xì)胞的促凋亡蛋白如cleaved-caspase3、BAK明顯上調(diào)而抗凋亡蛋白如BCL-XL、BCL-2明顯下調(diào)，PC9/GR中凋亡蛋白均變化不明顯(圖1E)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提示，吉非替尼可顯著抑制PC9細(xì)胞的皮下成瘤，而對PC9/GR的抑制并不明顯(圖1F)。以上結(jié)果表明PC9/GR細(xì)胞存在良好的吉非替尼耐藥性。qRT-PCR和Western 印跡檢測結(jié)果(圖1G)顯示，CXCR4在PC9/GR細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于PC9細(xì)胞。

圖1 PC9/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥性鑒定

2.2 抑制CXCR4對PC9/GR細(xì)胞耐藥的調(diào)控 結(jié)果(圖2)顯示：抑制PC9/GR細(xì)胞的CXCR4后，吉非替尼可顯著抑制細(xì)胞克隆形成(圖2A)；降低吉非替尼IC50(圖2B)；促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖2C)，上調(diào)促凋亡蛋白、下調(diào)抑凋亡蛋白(圖2D)，抑制細(xì)胞的EGFR下游信號通路(圖2E)；在體內(nèi)，吉非替尼可顯著抑制細(xì)胞的皮下成瘤(圖2F)。以上結(jié)果表明，CXCR4受抑后可顯著逆轉(zhuǎn)PC9/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥性。

圖2 抑制CXCR4可逆轉(zhuǎn)PC9/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥性

2.3 CXCR4過表達(dá)對PC9細(xì)胞耐藥的調(diào)控 過表達(dá)CXCR4后，PC9細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)(圖3A)；吉非替尼IC50顯著增加(圖3B)；抗凋亡能力明顯增強(qiáng)(圖3C、圖3D)；顯著抵抗吉非替尼對細(xì)胞EGFR下游通路的抑制作用(圖3E)；在體內(nèi)，CXCR4過表達(dá)細(xì)胞可顯著抵抗吉非替尼對皮下成瘤的抑制(圖3F)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)CXCR4可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥。

圖3 過表達(dá)CXCR4可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥

2.4 CXCR4過表達(dá)誘導(dǎo)PC9細(xì)胞耐藥的機(jī)制 結(jié)果(圖4)顯示：多種蛋白可直接結(jié)合于CXCR4分子，其中LDHA與CXCR4的結(jié)合豐度最高(圖4A)； CXCR4抗體可檢測到結(jié)合的LDHA(圖4B)，而LDHA抗體可檢測到結(jié)合的CXCR4(圖4C)。因此，LDHA和CXCR4存在相互作用。在PC9細(xì)胞中過表達(dá)CXCR4時，LDHA蛋白水平?jīng)]有改變，而LDHA的Y10磷酸化水平顯著增加(圖4D)；細(xì)胞的葡萄糖消耗量(圖4E)和乳酸生成量明顯上調(diào)(圖4F)。因此，CXCR4過表達(dá)可促進(jìn)LDHA磷酸化，從而增強(qiáng)細(xì)胞的有氧糖酵解。

圖4 CXCR4過表達(dá)促進(jìn)LDHA磷酸化并增強(qiáng)PC9細(xì)胞的有氧糖酵解

2.5 抑制CXCR4對PC9/GR細(xì)胞有氧糖酵解的調(diào)控 結(jié)果顯示：PC9/GR細(xì)胞中的pLDHA水平顯著高于PC9細(xì)胞(圖5A)，葡萄糖消耗量(圖5B)和乳酸生成量(圖5C)明顯升高。抑制CXCR4不改變LDHA表達(dá)，但顯著下調(diào)了PC9/GR細(xì)胞中的pLDHA水平(圖5D)，并明顯降低PC9/GR細(xì)胞的葡萄糖消耗量(圖5E)和乳酸生成量(圖5F)。因此，抑制CXCR4可下調(diào)PC9/GR細(xì)胞的LDHA磷酸化并降低其有氧糖酵解功能。

圖5 抑制CXCR4可下調(diào)PC9/GR細(xì)胞中LDHA磷酸化并降低有氧糖酵解

2.6 有氧糖酵解對細(xì)胞耐藥的影響 以糖酵解抑制劑(Oxamate和2-DG)預(yù)處理過表達(dá)CXCR4的PC9細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：吉非替尼可顯著抑制細(xì)胞增殖(圖6A)；明顯降低細(xì)胞的吉非替尼IC50(圖6B)；促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖6C)，上調(diào)促凋亡蛋白、下調(diào)抑凋亡蛋白(圖6E)；在體內(nèi)，吉非替尼可顯著抑制細(xì)胞的皮下成瘤(圖6D)。因此，抑制有氧糖酵解可逆轉(zhuǎn)CXCR4誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥。

圖6 抑制有氧糖酵解可逆轉(zhuǎn)CXCR4誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥

3 討 論

在過去的十幾年中，EGFR-TKIs使含EGFR敏感突變的非小細(xì)胞肺癌明顯受益。但是，EGFR-TKIs的臨床獲益是有限的：幾乎所有患者都不可避免地出現(xiàn)了疾病的進(jìn)展，此即EGFR-TKIs耐藥，也給肺癌的臨床治療帶來了新的困難[16-18]。因此，深入研究EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制，有針對性地制訂相應(yīng)策略，對控制病程、改善預(yù)后具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。

CXCR4作為一種7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，可異常表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，在與其配體SDF-1α結(jié)合后，酪氨酸激酶活性被激活，從而引發(fā)下游信號蛋白的酪氨酸磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。Phillips等[19]報道，多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中存在CXCR4高表達(dá)；干擾細(xì)胞的CXCR4表達(dá)或使用特異性抑制劑阻斷CXCR4通路后可明顯降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力。此外，CXCR4高表達(dá)可明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且與患者的總體預(yù)后負(fù)相關(guān)[20]。隨著研究的深入，CXCR4過表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥，阻斷CXCR4通路后可恢復(fù)癌細(xì)胞的化療敏感性[9-10]。引起我們關(guān)注的是，據(jù)Jung等[11]報道，野生型EGFR(A549/GR)的肺腺癌細(xì)胞在出現(xiàn)吉非替尼耐藥后，CXCR4的表達(dá)水平較母細(xì)胞(A549)顯著升高。但CXCR4是否參與了吉非替尼耐藥，尚無相關(guān)報道。本研究證實(shí)，PC9/GR細(xì)胞的吉非替尼耐藥性良好，且存在CXCR4明顯高表達(dá)，CXCR4受抑后可逆轉(zhuǎn)PC9/GR的吉非替尼耐藥；而在PC9細(xì)胞中過表達(dá)CXCR4后可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥。本研究首次揭示了在含EGFR敏感突變的肺腺癌細(xì)胞中，CXCR4的表達(dá)和活性對吉非替尼的藥物敏感性具有重要的調(diào)控作用。

與正常細(xì)胞在有氧條件下使用線粒體氧化磷酸化供能方式不同，腫瘤細(xì)胞即使在氧供充足的情況下亦優(yōu)先通過葡萄糖的糖酵解供能，即有氧糖酵解，以維持腫瘤細(xì)胞的無限增殖和持續(xù)生長，這種能量重編被稱為Warburg效應(yīng)[21]。作為有氧糖酵解的關(guān)鍵酶之一，LDHA可催化丙酮酸和NADH轉(zhuǎn)化為乳酸和NAD+，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。本研究證實(shí)，CXCR4不影響LDHA蛋白的表達(dá)水平；但是過表達(dá)CXCR4可顯著促進(jìn)細(xì)胞的LDHA磷酸化，上調(diào)有氧糖酵解水平；抑制CXCR4后細(xì)胞中LDHA磷酸化和糖酵解水平均顯著下調(diào)；抑制有氧糖酵解可逆轉(zhuǎn)CXCR4過表達(dá)所誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥。

本研究尚有不足之處：CXCR4是否同樣在含EGFR突變的其他細(xì)胞系，如HCC827、H1975等細(xì)胞中，發(fā)揮吉非替尼耐藥的調(diào)控作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證；另外，還需收集臨床肺腺癌腫瘤樣本，檢測吉非替尼耐藥前后的CXCR4和LDHA、pLDHA水平，進(jìn)一步驗(yàn)證CXCR4和LDHA的相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CXCR4過表達(dá)可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞產(chǎn)生吉非替尼耐藥；從機(jī)制上揭示了CXCR4過表達(dá)通過對LDHA磷酸化的促進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞有氧糖酵解功能；有氧糖酵解受抑后可顯著逆轉(zhuǎn)CXCR4誘導(dǎo)的吉非替尼耐藥。本研究為解釋吉非替尼耐藥的發(fā)生機(jī)制補(bǔ)充了理論基礎(chǔ)，對克服吉非替尼耐藥提供了新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。