健康人群中IgG類血型抗體高低效價間的腸道微生物差異

桑瑞瑞， 蔣 密， 戎瑞明,2,3， 周 蓉*

1. 復旦大學附屬中山醫院輸血科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院泌尿外科，上海 200032 3. 上海市器官移植重點實驗室，上海 200032

ABO血型系統是人類認識最早且最為普遍的血型分類系統。ABO血型系統的研究促進了現代輸血醫學的發展，并對器官移植排斥反應及母兒血型不合溶血病發病機制及疾病防治的研究起到重要推動作用。在ABO血型系統中，ABO血型抗原僅由遺傳基因決定，但是影響ABO血型抗體效價的因素是極其復雜的。人群中ABO血型抗體效價高低不一。當進行ABO血型不相容器官移植的術前處理或發生母兒血型不合溶血病等其他相關疾病時，臨床上往往需要通過血漿置換來降低ABO血型抗體效價[1-2]，這不僅增加患者的醫療負擔，而且治療效果也因人而異。因此，闡明影響ABO血型抗體效價的關鍵因素，進而幫助提高臨床治療效果是急需解決的科學問題。

在人體未經輸血、妊娠或注射抗原的情況下，人血清中存在的抗體能天然地與其自身紅細胞所缺乏的A、B抗原相對應，即在A型血人體中存在抗B抗體，同樣情況下在B型血人體中存在抗A抗體，O型血人體中存在抗A抗B抗體。ABO血型抗體主要為IgM類和IgG類。相較于IgM類抗體通過B1淋巴細胞介導，無需抗原刺激，“自發地”產生[3-4]，IgG類血型抗體的產生仍然是有爭議的。有研究[4-5]發現，介導適應性免疫的B2淋巴細胞受到生物界中細菌或食物表面的類血型抗原的刺激而產生IgG類血型抗體。人紅細胞膜上的ABH抗原決定簇是一類比較簡單的寡糖，在生物界非血型抗原體所特有，有些細菌表面也有類似的糖鏈結構[6]。因此，這些細菌具有與人紅細胞ABH相同的抗原活性，而且這些細菌廣泛分布于環境中，甚至存在人體腸道內，并不斷給B2淋巴細胞以類A類B抗原的刺激，從而產生ABO血型IgG類抗體[6-7]。

與人體共生的微生態系統包括口腔、皮膚、泌尿和胃腸道，以腸道微生態系統最為主要、最為復雜。腸道微生態系統由腸道微生物及其所生活的環境共同構成，腸道微生物是其核心部分。腸道微生物由約1 000種細菌和其他物種(如病毒、古細菌、真菌等)組成，其中最常見的是厚壁菌門(51%)和擬桿菌門(48%)[8]，其余1%的細菌屬于其他門，例如變形菌門(尤其是革蘭陰性和埃希桿菌屬)、放線菌門(尤其是革蘭陽性和雙歧桿菌屬)、梭桿菌門(革蘭陰性)、螺旋體門(革蘭陰性)、疣微菌門(革蘭陰性)和黏膠球形菌門(革蘭陰性)[9]。Springer等[7]調查了282種革蘭陰性菌，其中137種菌株中檢測到A、B和/或H抗原活性(49%)，例如E.coliO86和B組抗原，并將E.coliO86喂給O型血和A型血志愿者，導致抗B抗體效價的特異性升高。也有研究[10]指出，進行腸道手術患者的血型抗體效價升高8～32倍，可能是由于手術時腸道微生物暴露引起的。因此，腸道微生物中很大可能存在攜帶有A、B和/或H抗原活性的菌株，從而刺激B2淋巴細胞產生IgG類抗A和/或抗B抗體。目前，不同腸道微生物的物種組成和豐度是否影響ABO血型抗體效價，仍然是未知的。研究[11]發現接受長期腸外營養的幼兒中ABO血型抗體效價低，特別是抗B抗體。這可能是由于腸胃外營養本質上是“無菌的”，并導致糞便菌群豐度降低和改變[12]，從而對B2淋巴細胞的刺激減少。

本研究通過比較健康人群中O型血IgG類血型抗體效價高低水平的腸道微生物的物種組成和豐度，探討影響IgG類抗體效價水平的關鍵菌群。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2020年1月至2020年2月招募43例復旦大學在校學生為健康志愿者。納入標準：(1)體檢健康人群；(2)年齡18～30歲；(3)體質量指數(body mass index，BMI)18.5～23.9 kg/m2；(4)復旦大學在校學生。排除標準：(1)孕婦或生理期；(2)AB血型；(3)經常出差；(4)有輸血史；(5)精神疾病；(6)取樣前3個月內服用過抗生素或益生菌素片；(7)嚴重營養不良、感染、吸毒、吸煙或酗酒成癮者；(8)有家族遺傳病史、有腫瘤病史；(9)3個月內有嚴重腹瀉或便秘；(10)有胃腸道手術史；(11)1個月內因疾病服用過含堿式水楊酸鉍、Pepto-Bismol、Kaopectate、Maalox Total Relief Bismatrol、Pink Bismuth、Stomach Relief、Stress Walgreens Soothe和其他類似鉍堿式水楊酸鹽的藥物；(12)有自身免疫性疾病者，服用免疫抑制劑患者；(13)過敏性腸綜合征、炎癥性腸病、腸易激綜合征、持久性、傳染性胃腸炎、結腸炎或胃炎、持續或慢性腹瀉的病因不明、艱難梭狀芽胞桿菌感染(復發)、幽門螺桿菌感染(未治療)、慢性便秘、歷史性的胃或腸道潰瘍/胃腸道出血、腹痛、消化不良、胃腸里急后重(下墜)或排便困難、胃腸道息肉/包塊/發育不良或癌癥、腹瀉或傳染性胃腸炎；(14)合并嚴重的心臟、腦、肝、腎和造血系統疾病或其他嚴重的原發疾病。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(B2019-285)。

1.2 ABO血型抗體效價檢測方法 采集志愿者靜脈血4～5 mL，采用抗人球蛋白凝膠卡測定志愿者IgG類血型抗體效價。采用巰基試劑2-Me裂解其中的IgM類抗體，再將處理后的血清經連續倍比稀釋后與表達檢測目標抗體對應抗原的試劑紅細胞反應，以受檢血清凝集試劑紅細胞的最高稀釋倍數的倒數作為受檢血清中檢測目標抗體的效價。

1.3 樣本分組標準 根據《ABO血型不相容親屬活體腎移植臨床診療指南(2017版)》[13]和新生兒發生溶血病的抗體效價臨床臨界點[14]作為參考，將IgG類抗體效價的檢測結果分為高低組，分別是IgG類抗A抗體效價低水平組(OALG,抗體效價≤128)；IgG類抗A抗體效價高水平組(OAHG,抗體效價≥256)；IgG類抗B抗體效價低水平組(OBLG,抗體效價≤128)；IgG類抗B抗體效價高水平組(OBHG,抗體效價≥256)。

1.4 糞便樣本的采集 志愿者排凈小便后將糞便排入干凈的盛便器內，用一次性采樣勺將新鮮樣品轉移至采樣管中，每管2 g，立即凍存于-80℃冰箱備用。收集43例樣本,將O型血樣本送往北京市諾禾致源科技股份有限公司進行16S rRNA V3-4區域測序分析。

1.5 16S rRNA測序數據分析 測序得到的原始數據，存在一定比例干擾數據。首先對原始數據進行拼接、過濾，進而得到有效數據，然后基于有效數據進行Operational Taxonomic Unit(OTU)聚類和物種分類分析。根據OTU聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度分析，以得到樣本內物種豐富度和均勻度信息、不同樣本或分組間的共有和特有OTUs信息等。通過對腸道菌群進行α多樣性、β多樣性和線性判別分析(LEfSe，LDA閾值設為2)，比較ABO血型抗體效價高低組間群落結構的差異。

1.6 統計學處理 采用SPSS 25.0進行統計學分析，組間比較采用t檢驗和非參數檢驗，檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 健康人群ABO血型IgG類抗體效價分布情況 結果(表1)顯示：43例志愿者中A型血12例，B型血17例，未發現抗體效價≥256的樣本。O型血14例，抗體效價≥256的樣本8例。由于在A型血和B型血人群中未發現高水平抗體效價樣本，因此接下來只送檢O型血志愿者的糞便樣本。

表1 IgG類抗體效價的分布情況 n=43

2.2 腸道菌群的α多樣性分析 結果(圖1A)顯示：稀釋曲線出現平臺期，提示樣本測序深度達標。α多樣性指數(圖1B)表明：血型效價高低組間(OAHGvsOALG、OBHGvsOBLG)在屬水平上Shannon指數差異無統計學意義(P=0.4111、0.2278)。Veen圖(圖1C)顯示：OAHG組和OALG組共有的OTU個數為943個，OBHG組和OBLG組共有的OUT個數為745個。無論是OALG組還是OBLG組，特有的OUT個數均遠高于高水平效價組。

圖1 各組腸道菌群的α多樣性分析

2.3 菌群結構β多樣性分析 采用主坐標軸分析(PCoA)考察血型效價高低組腸道菌群β多樣性的差異。結果(圖2)顯示：樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。

圖2 基于OTU豐度的PCoA分析

2.4 腸道菌群結構分析 根據所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35(Top35，分組的豐度為組內所有樣品的平均豐度)的屬，根據其在每個樣本中的豐度信息，從物種和樣本2個層面進行聚類，繪制成熱圖(圖3A、3D)。在對OALG組和OAHG組的LEfSe分析中(圖3B)發現：有17個菌群的相對豐度在2組之間顯示出明顯差異。在OAHG組中觀察到細菌(包括梭狀梭菌、脆弱類桿菌、未分類的酸桿菌科、嗜鹽菌屬、泥渣梭菌、優桿菌屬、腸球菌、氣單胞菌目、未分類的菌屬、產堿桿菌屬、古氏類桿菌、未分類的丙型變形菌目、伯克氏菌科、毛螺菌科和普通擬桿菌)的豐度增高，主要集中在擬桿菌屬、梭菌屬和未分類菌屬，LDA分值>4的有毛螺菌科和普通擬桿菌，而Alistipesonderdonkii和華德薩特菌的豐度降低。在對OBLG組和OBHG組的LEfSe分析中(圖3E)發現：有13個菌群的相對豐度在2組之間差異明顯。在OBHG組中觀察到細菌(包括多枝梭菌、毛螺菌科_1_4_56FAA、瘤胃球菌屬_sp_W22、擬桿菌屬_sp_4_1_36、梭菌屬_sp_AT4和毛螺菌屬)的豐度增高，主要集中在厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門，LDA分值>4的有毛螺菌屬，而細菌(Muri菌科、紅蝽菌綱、紅蝽菌目、普雷沃氏菌科未確定菌屬、青春雙岐桿菌、革蘭陰性菌綱和Selenomonadales)的豐度降低。

圖3 基于菌群豐度的鑒定組間差異菌群

3 討 論

本研究發現O型血清IgG類抗A/B抗體效價顯著高于B/A型血清IgG類抗A/B抗體效價(P<0.001)。IgG類抗A/B抗體能夠通過母體胎盤，當母嬰血型不合時，胎兒或者新生兒可能會發生新生兒溶血病,且發病率與母體IgG類抗A/B效價正相關,一般認為只有當抗體效價≥128時,才有可能使新生兒發生溶血病[14]。臨床上通常以1∶128作為臨界值, 如果母親血清中IgG類抗A/B抗體效價≥256時，提示嬰兒很可能受害;如果母親血清中IgG類抗A/B抗體效價≥512時,發生率在80%以上，必須進行臨床預防性治療[15]。因此本發現能對O型孕婦容易發生新生兒溶血病作出較好的解釋。

本研究通過對比O型血IgG類抗體效價高低水平組的腸道微生物的結構和豐度，發現高低水平組的腸道微生物在屬水平上菌群多樣性(Shannon指數)差異無統計學意義，這可能是因為本研究的研究對象均為O型血，人類ABO血型通過微生物表面的血型抗原影響腸道菌群的組成[16]。但是通過LEfSe分析發現，高低水平組的腸道微生物菌群豐度存在顯著性差異。在對比屬水平上各菌群豐度時，本研究發現相比于OALG組，在OAHG組中毛螺菌科和普通擬桿菌富集。相比于OBLG組，在OBHG組中毛螺菌科富集。因為本研究對象為O型血人群，可以排除由于A/B血型抗原在腸黏膜層表達，充當腸道微生物的結合位點或碳源，導致腸道微生物菌群豐度的差異。由此推測可能由于這2種菌群本身或其代謝物具有類A/B抗原特性從而導致IgG類抗A/B抗體效價升高。菌群本身攜帶的抗原或代謝物是否與血型IgG類抗體生成有關還需進一步研究。此發現為接下來的機制研究提供切入點。

綜上所述，本研究以腸道微生物為重要突破口，創新性提出腸道微生物影響ABO血型抗體效價。不再是研究某一種細菌對ABO血型抗體效價的影響，而是從宏觀層面闡明在腸道微生態中，微生物組成及其豐度與血型抗體效價高低的關系，并且提出O型血中，血型效價高低水平間，在屬水平上腸道微生物菌群多樣性差異無統計學意義，但是在某些菌群的相對豐度上差異有統計學意義。這對闡明影響ABO血型抗體效價的關鍵因素提供一條新的科研思路，也可能會成為從根本上降低血型抗體效價的一種干預方法。