自閉癥相關Foxp1突變體Y435X的功能研究*

涂曉萌，郭志強，李 雪

（溫州醫科大學附屬眼視光醫院，眼視光學和視覺科學國家重點實驗室，浙江溫州325027）

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD），又稱孤獨性障礙或自閉癥，是一類復雜的神經發育疾病，在兒童中發病率高達1%～3%［1-2］。ASD致病原因相對復雜，并非單一致病機制的簡單失調，多認為是遺傳和環境因素共同作用導致的［3-4］。家族和雙胞胎的研究分析表明，同卵雙生的共患病率高達70%～90%，說明遺傳因素在ASD的發生中起著重要作用［5］。來自父母及患病兒童的全基因組測序分析發現，ASD患者中存在多個新生突變［6-9］。因此，針對臨床ASD風險基因的生物學功能研究，以及相關突變在大腦發育中的作用分析，將有助于揭示ASD的潛在致病機制。

研究表明，眾多自閉癥相關基因主要通過調控早期大腦正常發育而發揮作用［10-11］。ASD被認為與早期大腦發育異常有關。轉錄因子在這一過程中起到關鍵作用，可以調控相關基因的時空表達［12］。因此，鑒別在ASD發病以及大腦發育過程中關鍵轉錄因子調控的基因網絡，對于解析自閉癥發病機制具有重要指導意義。轉錄因子FOX家族的成員已被證實與ASD密切相關［13-14］。在多名ASD患者中發現FOXP1雜合子的缺失、點突變以及復制異常［15-17］。大規模外顯子測序進一步證實，FOXP1是多名ASD患者中的新生突變基因［18］，這使得FOXP1躋身成為ASD的高風險基因。

為了探索FOXP1突變導致ASD發生的作用機制，本課題克隆了小鼠Foxp1基因的突變體Y435X（蛋白序列比對等同于人Y439X），利用多種分子生物學技術，分析該突變體在細胞中的表達和亞細胞定位，以及在體異位表達對皮質神經元最終定位和形態發生的影響。通過對Foxp1突變體蛋白本身的功能研究，為自閉癥等神經系統疾病的分子機理研究開拓了新思路。

材料和方法

1 細胞與動物

小鼠神經母細胞瘤N2a細胞購于上海細胞資源中心。原代神經元于無菌條件下取自胚胎期ICR小鼠大腦皮質。清潔級ICR小鼠來自并繁殖于溫州醫科大學動物學實驗室。動物合格證編號為SYXK（浙）2020-0014。小鼠繁育主要通過當天晚上合籠，第2天分籠的方式，見栓則記為胚胎0.5 d（E0.5）。所有操作都嚴格遵循溫州醫科大學實驗動物和動物實驗相關管理條例進行。該研究本著實驗動物福利和倫理的原則，優化設計方案，嚴格計劃動物需要數量，實驗結束后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠（50 mg/kg），使小鼠安樂死。

2 主要試劑

2.1 細胞培養試劑 胎牛血清、0.25%trypsin-EDTA、HBSS和DMEM購自Gibco；青、鏈霉素購自Sigma；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和 表 皮 生 長 因 子（epidermal growth factor，EGF）購自R&D；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自上海生工公司。

2.2 主要試劑 驢血清購自Jackson ImmunoRe‐search；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Cell Signaling Technology；glycine、L-lysine和Triton X-100購自Sigma；PBS購自福州邁新生物技術有限公司；RNeasy Mini Kit購自QIAGEN；Power SYBR?Green PCR Master Mix購自Life Technologies；逆轉錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；β-巰基乙醇和萊普霉素B（leptomycin B，LMB）購自碧云天公司；多聚甲醛購自上海凌峰化學試劑有限公司；Opti-MEM和Lipofectamine 3000購自Invitrogen；點突變試劑盒購自天根生化科技有限公司。

2.3 實驗儀器 二氧化碳細胞培養箱和Automated Cell Counter（Invitrogen）；P-97拉針儀（SUTTER）；Electro Square Porator電擊儀（BTX）；HM505E冰凍切片機（MICROM）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 710）；PCR擴增儀（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 細胞培養和質粒轉染 N2a細胞培養在含有10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM中。細胞置于5%CO2培養箱中37℃培養。利用小鼠大腦cDNA文庫通過PCR擴增，得到全長Foxp1。Foxp1的上游引物序列為5'-ATGCAAGAATCTGGGTCTGAGAC-3'，下游引物序列為5'-GGTTCACTCCATGTCCT‐CATTTACTG-3'。通過EcoR I和NotI酶切位點將基因克隆到pCAGEN的載體上，得到Foxp1-pCAGEN。通過PCR將V5（GKPIPNPLLGLDST）標簽克隆到Foxp1-pCAGEN N端，得到V5-Foxp1-pCAGEN。在V5-Foxp1-pCAGEN上采用點突變試劑盒，引入Y435X點突變，得到V5-Foxp1-Y435X-pCAGEN。使用Lipofectamine 3000將構建的質粒轉染到N2a細胞中。

3.2 Western blot實驗 使用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA法檢測各蛋白濃度，加入loading buffer煮5 min后置于?20℃儲存。按照Western blot步驟對蛋白樣品電泳及電轉，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入Ⅰ抗［抗V5抗體（1∶5 000，Abcam）和抗α-tubulin抗體（1∶5 000，Sigma）］4℃孵育過夜，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統分析。條帶經掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics）進行灰度值計算分析。

3.3 子宮內胚胎基因轉染 用子宮內胚胎基因轉染技術將質粒轉染到大腦皮質前體細胞中。按劑量對孕鼠進行腹腔麻醉，腹部用70%酒精消毒。沿腹中線從上至下切開3～5 cm，打開孕鼠腹腔，輕輕取出子宮。挑選其中一個胚胎的頭部，微玻針吸取電轉質粒（4 g/L，約0.5μL）經孕鼠腹腔刺入胚胎側腦室；指示質粒（pCAGGS-GFP）∶目的質粒（pCAGEN或pCAGEN-V5-Y435X）=1∶5（體積比）。用電極緊夾吹入質粒后的胎鼠頭部，質粒側貼放正極，開始電擊：電壓38 V，間隔50 ms，共5個pulse。電擊操作完后把子宮放回腹腔，醫用縫合線逐層縫合腹膜及皮膚。用加熱光源照射孕鼠供暖促進蘇醒，孕鼠蘇醒后送回清潔動物房飼養。

3.4 細胞免疫熒光 4%多聚甲醛室溫固定N2a細胞或原代神經元15 min，0.3%Triton X-100破膜5 min，1×PBS洗2遍后加入適量的封閉液；室溫孵育1 h；加入Ⅰ抗［抗V5抗體和抗核纖層蛋白B（lamin B）抗體，1∶500，Abcam］，37℃孵育1 h；1×PBS洗3遍后，加入Ⅱ抗，37℃孵育1 h。免疫熒光圖片通過Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡獲得。

3.5 組織免疫熒光 小鼠用4%多聚甲醛灌注固定。取出相應時間的小鼠大腦，用4℃預冷的4%多聚甲醛后固定4 h至過夜（胚胎小鼠大腦固定4 h，成年小鼠大腦固定過夜）。標本加入30%蔗糖溶液脫水，用OCT包埋。使用HM505E冰凍切片機制作冰凍切片（厚度14μm）。免疫染色：大腦切片，加Ⅰ抗［抗V5抗體（1∶500，Abcam）、抗lamin B抗體（1∶500，Abcam）、抗GFP抗體（1∶1 000，Novus Biologicals）和抗GM130抗體（1∶300，Sigma）］4℃過夜；加Ⅱ抗，室溫孵育2 h。免疫熒光圖片通過Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡獲得。皮層分區通過DAPI染色確定。所有實驗至少重復3次以上。

4 統計學處理

Figure 1.Cytoplasmic expression of Foxp1 Y435X mutant in N2a cells.A：lysates of the N2a cells transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X were immunoblotted with V5 andα-tubulin antibodies；B：immunofluorescence staining of N2a cells was performed after transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X for 48 h.Nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=20μm.Ar‐rows indicated the nuclear location of WTFoxp1.Arrowheads marked the cytoplasmic aggregates of Y435X.圖1 Foxp1 Y435X突變體在N2a細胞中的表達及定位

數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。顯著性差異分析用SPSS11.5軟件進行t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Foxp1 Y435X突變體在N2a細胞中的表達及定位

Y439X是一個人類FOXP1的無義突變體，可以在亮氨酸拉鏈區和FOX DNA結合結構域之間截短，產生一個突變蛋白。為了探索FOXP1突變體Y439X的功能，我們首先克隆了小鼠的全長Foxp1及其突變體Y435X，分別連接V5的標簽。隨后，在N2a細胞中檢測Y435X的蛋白表達水平。Western blot結果顯示，V5-Y435X產生一個大約56 kD的截短蛋白，與全長Foxp1相比，表達量明顯增加（圖1A）。小鼠Foxp1與人類FOXP1相似，擁有2個保守的核定位信號，以及一個潛在的核輸出信號。Y435X突變所截短的蛋白位于第1個核定位信號后，丟失了全部的FOX區域和第2個核定位信號。為了確定突變體的亞細胞定位，我們在N2A細胞中利用免疫熒光技術檢測V5-Y435X的表達。野生型Foxp1連接V5的標簽，蛋白表達定位在細胞核；而突變體Y435X連接V5的標簽，表現出異常的亞細胞定位，在胞質中呈彌散性分布，并形成聚集物（圖1B）。這一發現與之前人類FOXP1 Y439X突變體無法定位核中，而在胞質產生聚集體的結果相一致［19］。以上結果說明Y435X突變后產生一個截短蛋白，并使得其亞細胞定位發生改變，這與其中一個核定位信號丟失有關。

2 Foxp1 Y435X突變體在N2a細胞中誘發核膜皺縮

蛋白質聚集與許多病理條件有關，包括幾種神經退行性疾病如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病，以及Ⅱ型糖尿病或傳染性海綿狀腦病。神經退行性疾病患者神經元中形成蛋白聚集體，可能會干擾細胞內高度保守的核質轉運（nucleo-cytoplasmic transport，NCT）功能［20-21］，這一機制可以保證核酸和蛋白運輸順利通過核膜，是神經元最基礎的信號通路。核膜主要在維持核形態、錨定核孔復合物、染色體組織及啟動DNA損失修復中發揮作用［22］。研究顯示核膜及核孔的損傷與神經退行性疾病以及生理狀態下神經元衰老有關［23］。本實驗在N2a細胞中瞬時轉染V5-Y435X或V5-Foxp1，利用lamin B抗體標記核膜上的核纖層蛋白，分析Y435X突變形成的聚集體是否會導致核膜形態異常。免疫熒光結果顯示，對照V5-Foxp1轉染組的細胞核膜完整，呈現圓潤的環形結構；而表達Y435X突變體的細胞核膜發生了皺縮，呈多褶皺狀，見圖2。

Figure 2.Foxp1 Y435X mutant induced nuclear membrane shrinkage in N2a cells.The N2a cells were transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X for 48 h.To visualize the nuclear morphological changes of the transfected cells，immunofluorescence staining of lamin Bwas performed.Nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=5μm.圖2 Foxp1 Y435X突變體在N2a細胞內誘發核膜皺縮

Foxp1含有一個潛在的核輸出信號，可以通過核輸出的選擇性抑制劑使其滯留在核中［24］。Y435X突變體可能由于蛋白錯誤折疊而暴露其核輸出信號，使得聚集體在胞質中易位表達。為了證實Y435X對NCT的影響，我們在轉染V5-Y435X的N2a細胞中加入核輸出阻斷劑LMB，利用免疫熒光技術檢測Y435X突變體的表達。結果顯示，加入對照溶劑的轉染組中，Y435X突變體主要在胞質中表達并形成聚集體；而當加入LMB后，Y435X突變體在胞核和胞質中均表達，見圖3。以上結果說明，Y435X聚集體可能通過核膜損傷而影響NCT，最終誘發ASD的發生。

3 Foxp1 Y435X突變體在原代皮質神經元中的表達和定位

為了確認Foxp1 Y435X突變體的在體表達情況，我們將pCAGEN-V5-Y435X或pCAGEN與指示質粒pCAGGS-GFP混合，再通過胚胎基因轉染的方法，共同導入E14.5小鼠側腦室。在E16.5時，分離轉染陽性的大腦皮質，制備成單細胞懸液，在24孔板中培養24 h。待細胞貼壁后，加入V5抗體，利用免疫熒光檢測Y435X的表達情況。如圖4所示，Y435X突變體不僅在神經元胞體的胞質中呈聚集體樣表達，還存在于分化的突起上。這表明Foxp1 Y435X突變體可能對神經元的形態發生產生一定的影響。

4 Foxp1 Y435X突變體干擾皮質神經元在大腦皮質的最終定位

神經元遷移到特定位置后，皮質分層建立，這一過程受多種胞外和胞內信號調節的肌動蛋白及微管骨架控制［25］。為了明確Foxp1 Y435X突變體對皮質分層的影響，我們采用胚胎基因轉染將Y435X質粒DNA轉染到E14.5的胚胎小鼠皮質前體細胞中。P2時取腦，切片觀察GFP陽性神經元是否存在滯留（分層異常）。在正常情況下P2的皮質神經元已完成了徑向遷移，對照組的GFP陽性神經元大多數已經遷移至Ⅱ～Ⅳ層，只有少量的細胞還存在Ⅴ～Ⅵ層和白質；轉染Y435X后，只有不足60%的細胞位于Ⅱ～Ⅳ層，而大量GFP陽性神經元異常定位于Ⅴ～Ⅵ層和白質，見圖5。以上結果表明，雖然Y435X突變對早期神經元徑向遷移無影響，但是對神經元的最終定位——皮質分層存在明顯的干擾作用。

5 Foxp1 Y435X突變體對皮質分層的影響具有長期效應

為了確定Y435X突變誘發的神經元異位是否具有長期效應，我們將E14.5電轉的小鼠在出生后P8和P16時取腦，切片分析GFP陽性神經元在皮質各層的分布。與上述P2時期結果相似，P8和P16時期對照組的GFP陽性細胞大多存在第Ⅱ～Ⅳ層，而表達V5-Y435X的細胞在Ⅱ～Ⅳ層中的比例顯著減少，Ⅴ～Ⅵ層中的異位神經元明顯增加，見圖6。這些數據表明，Y435X突變對皮質中神經元的定位和分層具有長期效應。

Figure 3.Nucleo-cytoplasmic transport was responsible for the cytoplasmic distribution of Foxp1 Y435X mutant.The N2a cells was transfected with V5-Y435X.After 48 h，the cells were treated with solvent ethanol or 2μg/L leptomycin B（LMB）for 3 h.To visualize the distribution of the transfected cells，immunofluorescence staining of V5 was performed.Nuclei were stained with DAPI（blue）.Arrows indicated the cytoplasmic location of Y435X.Arrowheads marked the nuclear and cyto‐plasmic expression of Y435X.The scale bar=50μm.圖3 Foxp1 Y435X突變體在胞質異常定位與核質轉運有關

Figure 4.Foxp1 Y435X mutant induced aggregates in the embryonic cortical neurons.E14.5 mouse embryos were electroporated with pCAGEN or V5-Y435X-pCAGEN，together with pCAGGS-GFP.After 48 h，single cell suspensions were prepared from the transfected brain，and the cells were attached on coverslips for immunofluorescence detection of V5（red）.Arrows indicated the differentiated neurites expressing Y435X.Nucleiwere stained with DAPI（blue）.Thescale bar=20μm.圖4 Foxp1 Y435X突變體在原代皮質神經元中誘導聚集物形成

6 Foxp1 Y435X突變體對深層異位神經元頂樹突方向的影響

Figure 5.Foxp1 Y435X mutant altered the neuron positioning after birth.E14.5 mouse embryos were electroporated with pCAGEN（A）or V5-Y435X-pCAGEN（B），together with pCAGGS-GFP.Brains were harvested at P2.Nuclei were counterstained with DAPI（blue）.The scale bar=100μm.C：statistical analysis of the percentages of GFP-positive cells that had reached the indicated regions of the cerebral cortex.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pCAGENgroup.圖5 Foxp1 Y435X突變體對出生后小鼠皮質神經元最終定位的影響

大部分上皮層錐體神經元在P2時完成遷移，到達最終位置的神經元形成樹突和軸突，再與其他神經元一起發育出有功能的突觸。錐體神經元的樹突又可以進一步細分為朝向軟腦膜表面生長的頂樹突，以及從胞體發出的具有多個分支的基樹突［26-27］。樹突作為神經元的主要結構，可以接收來自其他神經元和膠質細胞的信息輸入。因此，樹突的形態是神經系統功能正常發揮的決定性因素。在前期實驗中我們觀察到，P2時期滯留在第Ⅴ～Ⅵ層的細胞形態存在異常，其頂樹突方向似乎并未朝向軟腦膜生長（圖7A）。為了確定這一現象，我們通過胚胎基因轉染將Y435X質粒DNA導入E14.5的胚胎小鼠大腦皮質前體細胞中。在P2取腦，切片，利用GM130抗體（標記高爾基復合體基質）進行免疫熒光染色，分析Y435X表達對異位神經元頂樹突方向的影響。通常情況下高爾基復合體位于朝向軟腦膜表面生長的頂樹突中［27］。滯留在第Ⅴ～Ⅵ層的神經元只有（38.37±2.57）%的頂樹突朝向軟腦膜生長，而方向異常的滯留神經元比例可以高達（64.57±2.70）%，見圖7B、C。以上結果說明，在大腦皮質發育早期表達Y435X突變體將影響皮質神經元頂樹突的生長方向，使其極性改變。

討 論

為了探索人類FOXP1 Y439X突變導致ASD發生的細胞機制，我們首先克隆了小鼠Foxp1 Y435X突變體（根據蛋白序列比對，小鼠Y435X等同于人類Y439X），并在N2a細胞及原代培養的皮質神經元中利用免疫熒光檢測V5-Y435X的表達和定位。結果與之前文獻報道的結果相同：Foxp1 Y435X突變體以聚集體的形式，在N2a細胞和小鼠皮質神經元胞質中表達，這可能與一個核定位信號的丟失有關。

正常的NCT是保證轉錄因子入核的基本過程。核孔蛋白復合物（nuclear pore complex，NPC）是完成NCT的必要且保守的動態結構。分子量在40 kD、直徑在5 nm以下的小分子，可以相對自由地擴散通過NPC。相比之下，分子量相對較大的蛋白，則需要依靠高度精密調節的NCT機制［28］。即使NPC功能及完整性的微小損傷也將會逐漸積累，導致核蛋白在胞質中堆積，最終導致細胞死亡。蛋白聚集體是神經退行性疾病的一個獨特的病理學特點，包括肌萎縮側索硬化癥、阿爾茨海默病和亨廷頓病在內的多個神經退行性疾病均與NCT信號通路缺陷有關［29-30］。細胞骨架異常、蛋白聚集體形成和氧化損傷都是神經退行性疾病的共同特征，均能誘導NCT的缺陷，例如核膜上NPC的缺失、蛋白錯誤定位以及核纖層異常等。在培養N2a細胞時我們發現，轉染Y435X后48 h，有很多細胞崩解，隨后碎片化死亡。為了證實Y435X是否與NCT異常導致的細胞死亡有關，我們利用免疫熒光染色觀察突變體對N2a細胞核膜形態的影響，以及Y435X的表達是否與NCT異常有關。結果發現：轉染Y435X突變體后，細胞中核膜出現皺縮，而當加入LMB后，Y435X在核和胞質均有表達。因此推測Y435X可能通過影響NCT，進而導致ASD疾病的發生。后續我們還將利用多種方法，分析和檢測究竟哪些NPCs受到突變體的影響而發生定位的改變，借此進一步證實Y435X與NCT之間的相互關系。

Figure 6.Foxp1 Y435X mutant had a long-term effect on the neuron positioning after birth in mice.The pCAGEN or V5-Y435XpCAGENalong with pCAGGS-GFPwas tranfected into the dorsal telencephalon of E14.5 mouse embryos.Brains were har‐vested at P8（A）and P16（B）.The percentages of GFP-positive cells that had reached the indicated regions of the cerebral cortex were calculated.Nuclei were counterstained with DAPI（blue）.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pCAGENgroup.圖6 Foxp1 Y435X突變體對出生后小鼠皮質神經元最終定位的長期影響

完成細胞內初步功能分析后，我們又進行了突變體Y435X在大腦皮質神經元發育中作用的在體研究。通過子宮內胚胎基因轉染技術，在E14.5胚胎小鼠大腦皮質中過表達Y435X。P2時結果表明，Y435X在神經元定位中發揮作用，部分神經元異位出現在第Ⅴ～Ⅵ層。進一步對神經元形態的分析說明，異位神經元的頂樹突并未朝向軟腦膜表面，而是呈現出不規則的朝向。此外，定位改變還可以持續存在，直到P16，說明突變體的影響并不是短暫可以修復的，而是具有長期性的。神經元遷移、定位及形態發生是神經回路組裝的關鍵調控過程。在自閉癥患者的腦中，腦室周圍神經元異常堆積（室周異位）經常高比例出現［31］。后續可以采用離體腦片膜片鉗，評估異位神經元的電生理功能。神經元異位的機制相對復雜，推測可能由于Y435X誘發神經細胞產生大量聚集體，誘發NCT異常，進而影響神經元最終定位和形態發生，這可能是臨床上自閉癥相關FOXP1 Y439X突變癥狀出現的根本原因。對自閉癥相關Foxp1無義突變R521X（人類R525X）的研究表明，在胚胎發育早期過表達R521X可以誘導神經細胞（括皮質神經元）發生自噬而非無義突變介導的mRNA降解，并干擾神經元的徑向遷移［19］。因此，不同的ASD臨床表型，存在不同的致病機制，在未來的藥物靶點篩選時，需要采取不同的治療策略。

Figure 7.Foxp1 Y435X mutant altered the growth direction of apical dendrites in the cerebral cortex.A：V5-Y435X-pCAGEN along with pCAGGS-GFP was tranfected into the dorsal telencephalon of E14.5 mouse embryos，and brains were harvested at P2；B：the immunostaining of GM130（red）in ectopic neurons in the layersⅤ～Ⅵ；C：the proportion of the cells in the layersⅤ～Ⅵwith GM130 facing the pial surface as calculated from A.Arrows and arrowheads indicated the transfected neurons with or without apical dendrites facing to the pial surface，respectively.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs normal group.圖7 Foxp1 Y435X突變體對出生后小鼠皮質神經元頂樹突方向的影響

本課題使用過表達的方法對小鼠Foxp1突變體的功能進行研究，可以對基因敲除動物實驗進行補充。傳統基因敲除動物模型是假設雜合突變可以喪失一個等位基因，在體產生單倍體劑量不足的效應，目的在于重現人類基因突變產生的表型。但在過表達Y435X的神經元中，異常現象不可能僅由雜合缺失引起，而且有可能是由突變蛋白造成。Foxp1的蛋白高度保守，因此推測小鼠Y435X的人類同系物——FOXP1 Y439X突變體在人類大腦中可能會產生類似的作用，并且可以與FOXP1雜合缺失作用相疊加，加劇神經元的發育障礙，從而導致神經發育類疾病發生。