心臟成纖維細胞釋放的IL-6在阿霉素致SD乳鼠心肌細胞損傷中的作用研究*

滕嘉碩，李夢思，羅遠良，廖 嘉，吳森泉，王一陽，王華東，呂秀秀

（暨南大學基礎醫學與公共衛生學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理重點實驗室，廣東廣州510632）

阿霉素/多柔比星（doxorubicin，DOX）是一種蒽環類抗腫瘤藥物，被廣泛應用于白血病、淋巴瘤及實體瘤的治療［1］。隨著腫瘤幸存者人數的增加，長期使用DOX導致的不良影響，嚴重影響腫瘤愈后患者的生存質量，尤其對兒童腫瘤幸存者影響更為突出［2］。DOX可導致急性和慢性心臟毒性，DOX急性心臟毒性現在已經較為罕見，而DOX慢性心臟毒性，主要表現為劑量累積效應。研究顯示，當DOX累計劑量達到700 mg/m2時，充血性心力衰竭發生率高達48%。雖然發生心肌病在很大程度上是劑量依賴性的，但由于個體易感性的不同，低劑量使用DOX依然可以引起心肌病［3］。越來越多的研究顯示，在進行化療治療過程中或化療結束時，有些患者雖沒有明確的心功能障礙癥狀，但此時已經出現舒張功能障礙。因此，有研究者提出傳統觀點認為DOX慢性心臟毒性是晚發事件，可能僅代表實施檢測的時間，而不能真正反映其心臟毒性發生的時間［4］。目前，DOX引起舒張功能障礙的機制尚不完全清楚，心肌炎癥、心肌肥大、心肌表型的改變、纖維化以及間質增生、能量生成障礙等改變，均可導致心臟舒張功能障礙。

近年來，白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）在心力衰竭發生發展中發揮的作用日益受到關注。有研究指出，炎癥生物標志物對左室舒張功能有很好的預測潛力，特別是IL-6的水平和左室舒張功能之間具有很強的相關性［5］。相關研究顯示，輸注IL-6可通過非依賴血壓升高途徑，導致大鼠左心室肥厚；IL-6缺失會減弱血管緊張素Ⅱ和去甲腎上腺素誘導的小鼠心肌肥厚［6］。以上結果從不同層面肯定了IL-6在心肌肥厚發生發展中的作用。

有研究證實，在DOX慢性心臟損傷動物模型中，血清以及心臟組織中IL-6水平均顯著升高［7］。然而，IL-6在DOX慢性心臟毒性中發揮何種作用尚不確定。此外，IL-6來源十分廣泛，心血管系統中的內皮細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞以及心肌細胞都能產生IL-6［8］。不同刺激作用于心臟，誘導生成IL-6的效應細胞可能不盡相同，如在LPS刺激下，H9C2細胞會產生大量IL-6［9］；另有研究報道，β腎上腺受體激動后小鼠心肌組織中產生的IL-6則主要來源于心臟成纖維細胞（cardiac fibroblats，CF）而非心肌細胞（cardiomyocytes，CM）［10］。

因此，本研究旨在通過體外實驗，觀察DOX分別刺激SD乳鼠心臟成纖維細胞、心肌細胞后，IL-6釋放的情況，并進一步探討IL-6在DOX引起心肌細胞損傷中發揮的作用及機制，為臨床早期防治DOX慢性心肌病提供參考資料。

材料和方法

1 實驗動物

出生1～3 d的SPF級SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2018-0002。

2 主要試劑

DMEM培養液（Gibco）；PBS、HBSS和2.5%的不含EDTA不含酚紅的胰酶（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；青霉素、鏈霉素（Thermo Fisher）；10 mg DOX粉劑（瀚輝制藥有限公司）；TraKine?F-actin Staining Kit（Abbkine）；RIPA液、BCA試劑定量試劑和配膠試劑盒（碧云天公司）；共聚焦皿（Abcam）；Transwell 6孔板小室（Corning）和CCK-8工作液（Sigma）；IL-6的ELISA試劑盒及IL-6抗體（R&D）；GAPDH抗體（Ab‐cam）；心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（武漢三鷹公司）；腦鈉尿肽（brain natriuretic pep‐tide，BNP）抗體（萬類生物公司）；肌球蛋白重鏈7（myosin heavy chain 7，MYH7）抗體（Santa Cruz）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗小鼠Ⅱ抗（鼎國生物科技公司）。

3 主要方法

3.1 心臟成纖維細胞和心肌細胞的培養 取SD乳鼠，放入75%乙醇中消毒10 s，經異氟烷吸入麻醉后，將其四肢固定于泡沫板上，移入超凈臺內。用眼科剪打開胸腔，用眼科鑷夾取心臟，置于預冷的PBS中，使用眼科直鑷擠壓心臟兩側，洗去心臟內的殘血。剪取心臟組織，保留心臟的心室肌部分，將其剪碎至糜狀，加入5～10倍體積的0.125%的胰酶消化心臟組織，第1次消化7 min后，棄上清，再加入5～10倍體積的0.125%的胰酶消化5～7次。加入等體積的完全培養液于收集到的細胞上清液中，置于離心機中800×g，離心7 min。用完全培養液重懸細胞沉淀，接種于培養瓶中。放置于37℃、5%CO2的培養箱中培養2 h后，通過差速貼壁分離心肌細胞和心臟成纖維細胞，使用超順磁氧化鐵微球（SIOP）法提純心肌細胞。

3.2 CCK-8檢測心臟成纖維細胞和心肌細胞的活力 心臟成纖維細胞和心肌細胞培養48 h后，分為對照組，1、2和4μmol/L DOX處理組。37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養24 h后，每孔加入10μL的CCK-8工作液混勻，放入CO2培養箱中培養60 min。使用酶標儀在450 nm、570 nm雙波長處讀取每孔的吸光度（A）值，計算出各組成纖維細胞和心肌細胞的活力，從而確定后續實驗中DOX的使用劑量。

3.3 ELISA法檢測心臟成纖維細胞和心肌細胞上清中IL-6的含量 將心臟成纖維細胞和心肌細胞分別接種于96孔板中，48 h后給予1μmol/L DOX處理48 h后，收集細胞上清液，根據ELISA試劑盒的步驟依次進行操作，最后使用酶標儀測量450 nm處的A值，將540 nm或590 nm設置為校正波長。繪制線性標準曲線，計算成纖維細胞和心肌細胞上清中IL-6的含量。

3.4 免疫熒光染色觀察細胞骨架F-肌動蛋白（F-ac‐tin）的形態 鬼筆環肽（phalloidin）是一種從毒性菇類分離的多肽物質，通過其與細胞中F-actin的特異性結合而觀察細胞骨架蛋白中絲狀肌動蛋白的變化。心肌細胞和成纖維細胞培養48 h后，首先用1μmol/L DOX刺激心臟成纖維細胞24 h，形成條件培養液。然后將心肌細胞分成心肌細胞對照組、1μmol/L DOX處理心肌細胞組、成纖維細胞上清培養液處理心肌細胞組和條件培養液處理心肌細胞組。37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h后，吸去共聚焦皿中的培養液，加入PBS洗皿3次，每次5 min。加入1 mL提前預冷的4%多聚甲醛，室溫固定30 min后，加入PBS洗3次，每次5 min。加入0.1%的Tri‐ton X-100 1 mL，室溫打孔5 min。PBS洗皿3次，每次5 min。加入200μL staining solution，室溫下染色30 min。PBS洗2次后，每孔加入300μL的DAPI染液，室溫下避光孵育15 min。接著用PBS洗3次，每次5 min。然后放置于共聚焦顯微鏡下觀察。

3.5 Western blot檢測心肌細胞ANP、BNP和MYH7的蛋白水平 原代心肌細胞和成纖維細胞培養48 h后，運用Transwell小室共培養心肌細胞和成纖維細胞，上室接種成纖維細胞，下室接種心肌細胞，分為心肌細胞對照組、1μmol/L DOX處理心肌細胞組、共培養細胞對照組和1μmol/L DOX處理共培養細胞組。處理24 h后，棄去培養液，PBS洗3次，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解5 min，用刮刀刮取下室心肌細胞，收集細胞混合物于EP管中。4℃、6 000×g離心15 min，BCA法測定蛋白濃度，然后用5×loading buffer和RIPA裂解液調整待測樣本的濃度。取10μL的樣品進行SDS-PAGE，濕轉100 V，1 h轉至PVDF膜，TBST漂洗3次，每次5 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，用抗ANP（1∶1 000）、抗BNP（1∶1 000）、抗MYH7（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶1 000）的Ⅰ抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，用山羊抗兔（1∶10 000）和山羊抗鼠（1∶10 000）的Ⅱ抗室溫孵育1 h后，TBST漂洗10 min，洗3次。超敏ECL化學發光法顯色后，使用Image J圖像分析軟件測量灰度值。

3.6 Western blot進一步檢測使用IL-6抗體拮抗實驗中心肌細胞ANP和MYH7的蛋白水平 細胞共培養方法同上，將實驗分為4組：共培養細胞對照組、1μmol/L DOX處理共培養細胞組、10 mg/L IL-6抗體處理共培養細胞組和1μmol/L DOX+10 mg/L IL-6抗體處理共培養細胞組。處理24 h后，提取細胞。取10μL樣品進行SDS-PAGE，然后轉至PVDF膜上，TBST漂洗5 min，洗3次后，將條帶置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，用抗ANP（1∶1 000）、抗MYH7（1∶1 000）和抗GAPDH（1∶1 000）的Ⅰ抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，用山羊抗兔（1∶10 000）和山羊抗鼠（1∶10 000）的Ⅱ抗室溫孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。超敏ECL化學發光法顯色，ImageJ圖像分析軟件測量灰度值。

4 統計學處理

應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。統計資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組數據之間使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行檢驗，組間比較采用t檢驗分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DOX刺激24 h后心臟成纖維細胞和心肌細胞活力的變化

用1μmol/L、2μmol/L和4μmol/L的DOX處理心臟成纖維細胞和心肌細胞，加藥24 h后，檢測DOX對心臟成纖維細胞和心肌細胞的損傷情況。如圖1所示，DOX處理心臟成纖維細胞和心肌細胞24 h后，心臟成纖維細胞和心肌細胞的活力均顯著下降，與對照組比較均有統計學意義（P<0.01）。其中2μmol/L和4μmol/L DOX處理后，細胞存活率均低于50%，因此，我們選用1μmol/L的DOX來進行后續實驗。

Figure1.Effects of DOX on the viability of cardiac fibroblasts（CF）and cardiomyocytes（CM）.DOX significantly decreased the viability of CF and caused CM damage.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖1 DOX對心臟成纖維細胞和心肌細胞活力的影響

2 DOX刺激48 h后心臟成纖維細胞和心肌細胞上清中IL-6的水平

1μmol/L DOX處理心臟成纖維細胞和心肌細胞48 h后，ELISA檢測上清中IL-6的水平。如圖2所示，DOX處理48 h后，成纖維細胞上清中IL-6的含量顯著增加，與對照組相比差異有統計學意義（P<0.01）；但DOX處理心肌細胞48 h后，其上清中IL-6水平與對照組比較差異無統計學顯著性（P>0.05）。

3 DOX刺激成纖維細胞后的條件培養液對心肌細胞骨架F-actin的影響

如圖3所示，對照組心肌細胞和成纖維細胞上清培養液處理的心肌細胞中有完整的F-actin，肌絲排列整齊且清晰。而1μmol/L DOX處理的心肌細胞的F-actin排列紊亂、斷裂。條件培養液處理的心肌中F-actin不僅出現斷裂，而且還出現肌絲變成圓形或聚集在細胞邊緣、長肌絲斷裂消失等現象。

4 DOX處理可促進共培養的心肌細胞及成纖維細胞體系中心肌細胞肥大相關蛋白的表達

Figure 2.The release of IL-6 from cardiac fibroblasts（CF）and cardiomyocytes（CM）after DOX treatment was detect‐ed by ELISA.DOX promotes the release of IL-6 from CF，but the release of IL-6 from CM did not increase significantly.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖2 DOX處理心臟成纖維細胞和心肌細胞48 h后細胞上清中IL-6的含量

如圖4所示，1μmol/L DOX處理心肌細胞24 h后，ANP、BNP及MYH7的蛋白表達顯著高于對照組心肌細胞（P<0.01），1μmol/L DOX處理的共培養組中，心肌細胞ANP、BNP及MYH7的蛋白表達顯著高于1μmol/L DOX處理的心肌細胞（P<0.01）。

5 IL-6抗體可抑制DOX誘導的心肌細胞及成纖維細胞共培養體系中心肌細胞ANP和MYH7的蛋白表達

10 mg/L IL-6抗體處理DOX刺激的共培養細胞24 h后，共培養體系中心肌細胞ANP及MYH7的蛋白表達顯著低于1μmol/L DOX處理的共培養細胞組（P<0.05）。10 mg/L IL-6抗體處理的共培養細胞組組心肌細胞中ANP及MYH7的蛋白表達和對照組比較差異沒有統計學顯著性（P>0.05），見圖5。

討 論

Figure 3.Phalloidin staining to observe the morphological changes of cytoskeletal protein F-actin.The green staining position is F-ac‐tin，while the blue staining is DAPI.The scale bar=50μm.圖3 鬼筆環肽染色后熒光顯微鏡觀察細胞骨架蛋白F-actin形態

Figure 4.Effects of DOX on the protein levels of ANP,BNPand MYH7 in cardiomyocytes were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs CM group；##P<0.01 vs CM+DOX group.圖4 Western blot檢測DOX處理對心肌細胞中ANP、BNP和MYH7蛋白表達水平的影響

自上世紀以來，國內外學者對DOX心臟毒性的機制進行了大量研究，并相繼提出了多種假說，包括氧化應激損傷、線粒體功能異常和心肌細胞凋亡等［11］。然而，到目前為止，DOX慢性心臟毒性的機制尚不清楚。隨著臨床檢測心功能手段不斷完善，DOX慢性心臟毒性早期就會出現舒張功能障礙。如果將心肌細胞作為唯一細胞靶點，很難對上述現象進行闡述。心臟中其它類型細胞陸續被提出作為DOX心臟毒性的細胞靶點［12］。心臟中非心肌細胞的數量遠多于心肌細胞，包括心臟成纖維細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞等。其中，心臟成纖維細胞在促進細胞外基質形成，以及維持心功能方面的意義已被認可［13］。我們的前期研究證實：DOX能刺激原代培養的SD乳鼠心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，同時釋放大量的炎癥因子，其中就包括IL-6［14］。此外，有研究顯示，DOX心臟損傷動物模型中，血清以及心臟組織中IL-6水平均顯著升高。鑒于IL-6的水平和左室舒張功能之間具有很強的關聯性。因此，我們推測IL-6在DOX慢性心臟毒性中發揮著一定作用。鑒于不同刺激作用于心臟，誘導生成IL-6的效應細胞可能不盡相同，心肌細胞、內皮細胞以及成纖維細胞均可產生IL-6，在不同的刺激條件下，產生IL-6的細胞種類也不近相似。DOX刺激后，心臟組織中升高的IL-6到底來源于何種細胞，尚未見報道。

Figure 5.Effects of DOX and IL-6 antibody on the protein levels of ANP（A）and MYH7（B）in cardiomyocytes were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs CM+CFgroup；#P<0.05 vs CM+CF+DOX group.圖5 Western blot檢測DOX和IL-6抗體對心肌細胞中ANP和MYH7蛋白表達水平的影響

因此，本實驗首先通過CCK-8法檢測DOX對原代培養的心臟成纖維細胞和心肌細胞活力的影響，確定DOX的使用劑量和作用時間。選取1μmol/L DOX分別處理SD乳鼠的心臟成纖維細胞和心肌細胞48 h后，ELISA法測定成纖維細胞和心肌細胞上清中IL-6的含量，結果表明：1μmol/L DOX能促進心臟成纖維細胞釋放大量的IL-6，但是心肌細胞釋放IL-6并沒有顯著增加。這表明DOX刺激后，心臟組織中的IL-6主要來源于成纖維細胞。

IL-6具有多種生物學活性，除了具有促炎、抗炎特性，它還具有類似激素的行為特征。IL-6主要可通過經典的IL-6受體信號通路和反式激活IL-6受體信號，參與調節哺乳動物的心臟細胞存活、凋亡、肥大和膠原合成等多個過程［15］。DOX刺激成纖維細胞釋放的IL-6，在DOX心臟毒性中發揮何種作用尚未見報道。

根據實驗的需求，我們分別采用條件培養液和Transwell小室共培養模擬體內心肌細胞和成纖維細胞共存的微環境，觀察了1μmol/L DOX刺激24 h后，心肌細胞骨架蛋白形態的改變，結果表明條件培養液可導致心肌細胞肌絲排列紊亂、斷裂。

當各種刺激導致心臟代償或者失代償肥大時，ANP的表達增加。BNP是由心肌細胞合成的具有生物學活性的天然激素，主要在心室中表達，常被作為心衰定量標志物，當心臟出現損傷時，BNP的表達顯著增加。MYH7是心肌的重要組成部分，當心肌出現肥厚損傷時，MYH7的表達顯著增加。因此我們應用Western blot實驗檢測心肌細胞ANP、BNP和MYH7的蛋白表達水平，結果顯示，DOX刺激24 h后，成纖維細胞及心肌細胞共培養組中心肌細胞ANP、BNP和MYH7的蛋白表達水平高于心肌細胞組。以上結果提示，原代細胞培養的成纖維細胞在DOX誘導心肌損傷和肥大中發揮著作用。但尚不確定這種作用是否與心臟成纖維細胞釋放的IL-6相關。

為了進一步驗證IL-6在DOX誘導心肌損傷和肥大中的作用，我們通過體外實驗使用IL-6抗體，目的在于拮抗/中和DOX刺激成纖維細胞釋放的IL-6后，觀察心肌細胞ANP、MYH7的蛋白水平是否發生變化。結果顯示加入了IL-6抗體后，共培養組中反應心肌損傷和肥大的蛋白表達顯著下降。

綜上所述，雖然前期已有研究顯示DOX刺激后，心臟組織和血清中會產生大量的IL-6，但并未闡述DOX誘導產生IL-6的細胞來源，更沒有提及IL-6在DOX誘導心肌細胞損傷中的作用。本研究通過體外實驗，初步觀察到DOX刺激作用下，原代培養的心臟成纖維細胞會分泌大量IL-6，而并不會刺激原代培養的心肌細胞釋放大量的IL-6。同時，利用條件培養液和Transwell小室共培養方式，模擬體內心肌細胞和成纖維細胞共存的微環境，觀察DOX刺激作用下，原代培養的心臟成纖維細胞分泌的IL-6對心肌細胞肥大、損傷的作用。但DOX引起心臟成纖維細胞產生釋放大量IL-6的機制，以及IL-6通過何種信號傳導途徑，實現促心肌肥大損傷的？本課題尚未闡述。此外，還需進一步確定心臟中的其它細胞類型如內皮細胞和血管平滑肌細胞在DOX刺激下產生IL-6的情況及IL-6在DOX慢性心臟毒性中的作用，這也將是今后課題需要開展的重要內容。