柚皮苷抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導的細胞焦亡*

王婷婷，張 健，張再媛，肖雯婧，侯 君，陳 欣，呼永河△

（1西南交通大學醫學院，四川成都610031；2中國人民解放軍西部戰區總醫院基礎醫學實驗室，四川成都610083；3中國人民解放軍西部戰區總醫院藥劑科，四川成都610083；4成都市第三人民醫院檢驗科/西南交通大學附屬醫院，四川成都610014）

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/re‐perfusion injury，MI/RI）是指心肌冠狀動脈障礙，血流無法通過冠脈流入，一定時間內冠脈恢復血流后，心肌的損傷程度較缺血時更為嚴重［1］。再灌注后會誘發心律失常和微循環障礙等癥狀，從而使心肌梗死面積增加，心肌損傷加重。MI/RI發病率高和死亡率都很高［1］，然而MI/RI的治療一直是一個難題，臨床上廣泛使用的藥物如環孢素A存在需要特異性受體結合以及對其他正常器官和組織有免疫抑制的缺點［2］，因此應用受到限制，臨床上缺乏成熟高效的治療手段和藥物，因此，尋找治療MI/RI的藥物具有重要的意義。

柚皮苷（naringin，Nar）全稱為柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，一種黃酮類化合物，是中藥骨碎補、化橘紅等的有效成分。研究發現它能夠通過抗氧化［3］、抗炎［4］、改變血流動力學［5］、抑制細胞凋亡［6］等機制對MI/RI有抑制作用，還能對抗高糖引起的心肌細胞損傷［7］等。在2015年，中山大學李沛波等［8］就已經獲得柚皮苷一類新藥臨床批件，說明柚皮苷具有良好的成藥性。但是到目前為止，關于柚皮苷對減輕MI/RI的機制一直沒有闡明。

細胞焦亡（pyroptosis）是程序性細胞死亡的一種形式，最終導致炎癥失控是許多慢性疾病發生發展的基礎，包括MI/RI［9］。細胞焦亡近年來備受關注，它的出現與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like recep‐tor protein 3，NLRP3）炎癥小體通路的激活息息相關［10］。目前已發現柚皮苷通過抑制NLRP3炎癥小體的產生可減輕小鼠潰瘍性結腸炎［11］，治療大鼠糖尿病腎病［12］，抑制糖尿病小鼠心肌重構［13］，但關于柚皮苷通過抑制細胞焦亡減輕MI/RI的研究很少。因此，本文旨在探討柚皮苷對大鼠MI/RI的作用及其機制。

材料和方法

1 動物

45只SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自成都達碩實驗動物有限公司，體重在250～300 g，動物合格證號為SCXK（川）2020-030。術前飼養環境：12 h光照/黑暗循環；環境溫度（23±2）℃；（55±5）%濕度；通風良好；無噪音環境；食物和水自由，術前12 h禁食不禁水。

2 主要試劑

柚皮苷單體購自上海麥克林生化；丙二醛（molondialdehyde，MDA）ELISA檢測試劑盒（江蘇江萊生物）；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18和caspase-1 ELISA檢測試劑盒（南京建成）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（南京建成）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）檢測試劑盒（蘇州科銘）；HE染色試劑盒和改良Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶）；伊文思藍和氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自BIO‐FROXX；凱基全蛋白提取試劑盒和凱基BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基）；兔抗procaspase-1+p10+p12單克隆抗體、兔抗NLRP3多克隆抗體、兔抗gasdermin D（GSDMD）單克隆抗體、小鼠抗GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔IgG H&L（HRP）和山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）均購自Abcam；小鼠抗含cas‐pase募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase re‐cruitment domain，ASC）單克隆抗體（Santa Cruz）。

3 主要方法

3.1 動物分組 45只SD大鼠隨機分為5組（每組動物用于心肌梗死面積測定3只，HE染色和Masson染色3只，心肌組織SOD活性、SOD抑制率和MDA含量測定及Western blot實驗3只，共9只）：假手術（sham）組，冠狀動脈 左前降支（left anterior de‐scending coronary artery，LAD）只穿線不結扎，生理鹽水于穿線后30 min腹腔注射；模型（MI/RI）組，心肌缺血30 min，生理鹽水于缺血30 min后腹腔注射，然后打開活扣再灌注2 h；柚皮苷低劑量（NarL）組，心肌缺血30 min，10 mg/kg柚皮苷于缺血30 min后腹腔注射，然后打開活扣再灌注2 h；柚皮苷中劑量（NarM）組和柚皮苷高劑量（NarH）組，柚皮苷使用劑量分別為50 mg/kg和100 mg/kg外，余方法同上。

3.2 大鼠MI/RI模型的建立 1%戊巴比妥鈉（35～40 mg/kg）腹腔麻醉，照射加熱燈，保證大鼠直腸溫度維持在36.5～37.5℃之間。剪開頸部皮膚，將連接小動物呼吸機的塑膠管插入氣管，設置小型動物呼吸機參數：呼吸比1∶1，呼吸頻率每分鐘75次，潮氣量20 mL。通過左胸廓切開術打開胸腔，在胸骨的左邊緣2 mm處以及在第二和第三肋骨點之間進行縱向切口，并切開心包，使心臟外露，使用6/0尼龍線穿過LAD近端部分下方的心肌，將LAD系在活結中，使結扎末端外露。在冠狀動脈閉塞30 min后，打開活結恢復冠狀動脈血流2 h，然后通過捆扎先前放置的縫合線閉合大鼠胸部［14］。在再灌注2 h結束時，從腹主動脈取血樣，離心后收集血清，收集血清樣品后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌。將血清樣品保存在?20℃中，將組織樣品保存在?80℃中直至分析。

3.3 心肌梗死面積染色 再灌注2 h結束后，原位結扎LAD，將2%伊文思藍染料注入頸靜脈，待大鼠口唇變藍1 min后，從頸靜脈的另一側注入1%TTC，等待數分鐘后切除心臟，將心臟從基底部到心尖沿房室溝切成橫向的1 mm厚的切片，放置到含4%多聚甲醛的尿杯中固定過夜。被伊文思藍染成藍色的區域沒有風險，沒有染色的組織是風險缺血區域（area at risk，AAR）。AAR中缺血但未梗死的活組織被TTC染成紅色（TTC陽性），壞死組織不被染色，呈現白色（TTC陰性）。體式顯微鏡對大鼠心臟切片進行拍照，ImageJ軟件測量照片中的面積。計算以下參數：（1）梗死程度（%），梗死面積（IS）與AAR的比率（IS/AAR）；（2）缺血面積（%），AAR與左心室面積（LV）的比率（AAR/LV）。

3.4 大鼠心肌組織的HE染色 再灌注2 h結束后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌，4%多聚甲醛于尿杯中固定24～48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后將心臟組織包埋在石蠟中，切成4μm的石蠟片，烤片機上烘干1 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木素、伊紅染色；梯度乙醇脫水，自然風干，于組織中部滴入中性樹膠，蓋玻片封片，觀察其病理變化。

3.5 大鼠心肌組織的Masson染色 再灌注2 h結束后，立即切除心臟并用冷鹽水洗滌，如3.4所述制成常規的石蠟切片，切片脫蠟，浸入媒染液，放入60℃的恒溫孵育箱內1 h，水洗，天青石藍滴染，水洗，Mayer蘇木素滴染，水洗，酸性乙醇分化，沖洗，麗春紅品紅滴染，水洗，磷鉬酸，傾倒液體，滴加苯胺藍，弱酸洗，95%乙醇、無水乙醇脫水，自然風干，于組織中部滴入中性樹膠，蓋玻片封片，觀察大鼠心肌組織膠原纖維的變化情況。

3.6 大鼠血清LDH和CK活性及IL-1β、caspase-1和IL-18含量的測定 再灌注2 h結束后，腹主動脈取血，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。紫外分光光度計測定樣品中LDH和CK的活性。（1）LDH活性定義：1 000 mL細胞培養上清液于37℃與基質作用15 min，在反應體系中產生1μmoL丙酮酸為1個單位。計算公式：LDH活性（U/L）=（測定A值?對照A值）÷（標準A值?空白A值）×標準品濃度（0.2 mmol/L）×1 000。（2）CK活性定義：37℃，pH 7.0時，每升血清1 min內催化產生1μmoL NADPH為一個單位。計算公式：CK活性（μmol·min?1·L?1）=ΔA÷（ε×d）×V總÷V樣÷T=1 608×ΔA。其中，ε為NADPH摩爾消光系數，6 220 L·mol?1·cm?1；V總為反應總體積，0.2 mL；V樣為反應中樣本體積，0.04 mL；T為反應時間，1 min。按照ELISA試劑盒測定IL-1β、IL-18和caspase-1含量的變化。

3.7 大鼠心肌組織內源性抗氧化劑SOD活性和MDA含量的測定 再灌注2 h結束后，從大鼠心尖剪取心肌組織30 mg，置入研缽內與0℃的PBS一起勻漿。4 000 r/min離心10 min，收集上清液。SOD試劑盒測定活性，按照ELISA試劑盒測定MDA，最終借助紫外分光光度計測定樣品中MDA的含量變化。SOD活性定義：在反應中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為一個SOD活性單位（U）。計算公式：SOD抑制率（%）=［（A對照?A對照空白）?（A測定?A測定空白）］÷（A對照?A對照空白）×100%；SOD活性［×103U/（g protein）］=SOD抑制率÷50%×反應體系（0.24 mL）÷稀釋倍數（0.02 mL）÷待測樣本蛋白濃度［（g protein）/L］。

3.8 Western blot檢測細胞焦亡相關蛋白表達水平 再灌注2 h后將心肌組織剪碎，稱取30 mg大鼠心尖心肌組織，加入RIPA裂解液與PMSF研磨勻漿，BCA蛋白提取試劑盒提取大鼠心尖部的心肌組織總蛋白，定量，上樣，電泳，切膠，轉膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，Ⅰ抗室溫孵育1 h，4℃過夜；TBST洗，Ⅱ抗室溫孵育1 h。TBST洗，顯色并利用UVP成像儀成像。以GAPDH為內參照，ImageJ軟件計算各條帶的灰度值，比較各組差異。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。實驗數據均以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較選用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 柚皮苷對大鼠梗死和缺血面積的影響

伊文思藍-TTC復染結果顯示，與sham組相比，MI/RI組梗死面積和缺血面積均顯著增加（P<0.05）；與MI/RI組比較，柚皮苷各給藥組的梗死和缺血面積均顯著減少（P<0.05），見圖1。

Figure 1.The effects of naringin（Nar）on myocardial infarction and ischemic areas in the rats.A：myocardial infarction area；B：myocardial ischemic area.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖1 柚皮苷對大鼠心肌梗死和缺血面積的影響

2 大鼠心肌組織HE染色結果

HE染色結果顯示，sham組和NarH組大鼠的心肌組織較正常，心肌細胞形態結構輪廓分明且完整，纖維結構規則無明顯空隙，排列整齊而緊密；MI/RI組大鼠的心肌細胞形態不規則，出現破裂和壞死，細胞間隙顯著增大，纖維結構有斷裂，有紅色血樣斑塊出現，局部出現少量的炎癥細胞；NarL組和NarM組細胞形態相比MI/RI組較規則，破裂和壞死減少，細胞間隙減小，纖維結構斷裂減少，有少量紅色血樣斑塊出現并伴有極少量的炎癥細胞，見圖2。

3 大鼠心肌組織Masson染色結果

Masson染色結果顯示，sham組和NarH組大鼠的心肌細胞排列有序；MI/RI組大鼠的心肌細胞排列紊亂，少部分膠原纖維陽性染色；NarL組和NarM組細胞形態較規則，幾乎無膠原纖維陽性染色，見圖3。

4 大鼠血清心肌損傷標志物的變化

Figure 2.HEstaining of the rat myocardial tissues（×40）.圖2 大鼠心肌組織HE染色

血清心肌損傷標志物的檢測結果顯示，sham組中LDH和CK活性較低，發生MI/RI后，其活性顯著增加（P<0.05）；柚皮苷各組的LDH活性均較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarM和NarH組中CK活性較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarL組中CK活性與MI/RI組比較差異無統計學顯著性，見圖4。

5 柚皮苷對大鼠血清炎癥因子水平的影響

Figure 3.Masson staining of the rat myocardial tissues（×40）.圖3 大鼠心肌組織Masson染色

Figure 4.The serumactivities of LDH and CK in the rats.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖4 大鼠血清LDH與CK活性的比較

ELISA結果顯示，sham組中IL-1β、IL-18和cas‐pase-1含量較低，發生MI/RI后，其含量顯著增加（P<0.05）；柚皮苷各組的IL-1β和caspase-1含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），NarH組IL-18含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），但NarL和NarH組IL-18含量與MI/RI組比較差異無統計學顯著性，見圖5。

Figure 5.The serum levels of IL-1β，IL-18 and caspase-1 in the rats.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RI group.圖5 大鼠血清IL-1β、IL-18和caspase-1水平的比較

6 大鼠心肌組織SOD活性和抑制率及MDA含量的變化

sham組中SOD活性和抑制率較高，發生MI/RI后，這2個指標均顯著降低（P<0.05），NarH組中SOD活性和抑制率較MI/RI組顯著升高（P<0.05），NarL和NarH組中SOD活性和抑制率與MI/RI組比較差異無統計學顯著性；sham組中MDA含量較低，發生MI/RI后，其含量顯著增加（P<0.05），柚皮苷各組中MDA含量較MI/RI組顯著減少（P<0.05），見圖6。

7 柚皮苷對大鼠心肌細胞焦亡通路相關分子表達的影響

Western blot結果顯示，發生MI/RI后，細胞焦亡效應分子GSDMD、細胞焦亡通路標志分子NLRP3及炎癥小體通路的標志蛋白caspase-1和ASC的水平均顯著升高（P<0.05）；柚皮苷各組NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白水平較MI/RI組顯著降低（P<0.05），NarM組與NarH組的ASC蛋白水平較MI/RI組顯著降低（P<0.05），見圖7。

Figure 6.The activity（A）and inhibitory rate（B）of SOD，and the level of MDA（C）in rat myocardial tissues.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖6大鼠心肌組織SOD活性和抑制率及MDA含量

Figure 7.The protein levels of ASC，caspase-1，GSDMD and NLRP3 in rat myocardial tissues were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs sham group；#P<0.05 vs MI/RIgroup.圖7 Western blot檢測大鼠心肌組織ASC、caspase-1、GSDMD和NLRP3的蛋白水平

討 論

本實驗通過建立大鼠MI/RI模型，研究柚皮苷對MI/RI的治療作用。研究發現，柚皮苷減少缺血大鼠的心肌梗死面積和缺血面積，減輕其病理結構的改變及纖維化的形成，降低心肌損傷標志物LDH和CK活性，減少炎癥因子IL-1β、IL-18和MDA含量，增加SOD活性和抑制率，同時降低與細胞焦亡相關的蛋白ASC、caspase-1、GSDMD和NLRP3的表達，柚皮苷對大鼠MI/RI的保護作用可能與細胞焦亡信號通路有關。

細胞焦亡屬于caspase-1依賴性細胞死亡，細胞受到外界缺氧刺激后，機體的一系列調控反應作出的自殺行為。通常是由GSDMD介導的細胞炎性壞死，而激活GSDMD的正是NLRP3炎癥小體通路中的caspase-1［9］，因此，細胞焦亡的發生其實就是通過NLRP3炎癥小體來完成的，二者之間有緊密的聯系。

NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復合物，其激活機制有許多觸發因素，包括K+外排、Ca2+超載、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）釋放、內質網應激、溶酶體滲漏和線粒體功能障礙，其中前兩者是NLRP3炎癥小體激活的重要機制［15］。當發生MI/RI后，大鼠體內會有大量的Ca2+內流和ROS累積，這一改變會觸發NLRP3炎癥小體的激活［16］，NLRP3激活后會使焦亡相關蛋白ASC寡聚化，并激活caspase-1，caspase-1的兩個活性剪切體p10和p12脫落并形成具有活性的四聚體，下游促炎癥細胞因子IL-1β和IL-18會在該四聚體裂解后被激活，炎癥反應因此發生［15，17］，隨后機體出現病理性反應。作為炎性小體通路中激活細胞焦亡的效應分子，GSDMD由其N末端（N‐terminal of GSDMD，NT-GSDMD）和C末端（C‐terminal of GSDMD，CT-GSDMD）兩個部分組成。其中，能夠促進膜孔形成并最終介導細胞焦亡的是NTGSDMD，它還能促進細胞因子和其他炎癥因子的釋放［15］。在上述促炎因子釋放的同時，caspase-1裂解和激活GSDMD，并寡聚NT-GSDMD，破壞細胞膜，介導膜孔的形成，膜孔的形成進一步促進促炎因子的釋放，細胞內外滲透壓差消失，細胞發生腫脹，最終焦亡［9］。上述作用可以被活化蛋白C（activated pro‐tein C，aPC）［18］及沉默信息調節因子2相關酶1（si‐lent information regulator factor 2-related enzyme 1，SIRT1）［19］有效抑制。細胞焦亡在炎癥中起著至關重要的作用，并且已在不同的心血管疾病中被廣泛研究［20-21］。細胞焦亡已被證實參與心肌細胞缺氧/復氧損傷以及腦缺血再灌注損傷［22］。此外，大量的研究表明抑制細胞焦亡能夠有效減輕MI/RI，例如大黃素通過抑制GSDMD減輕MI/RI誘導的細胞焦亡［23］，mi‐croRNA-29a通過靶向SIRT1并抑制氧化應激和NLRP3介導的細胞凋亡途徑來減輕MI/RI［19］。柚皮苷也已被證實具有抑制細胞焦亡中NLRP3炎癥小體的作用［11-12］。本研究表明，柚皮苷能夠減輕MI/RI引起的細胞焦亡，主要是通過抑制NLRP3炎性小體的釋放，減少細胞焦亡效應分子GSDMD及其上游分子caspase-1的水平，以及炎癥小體通路標志物ASC、IL-1β和IL-18的水平。

之前的研究大部分是MI/RI造模前的預處理給藥方式，是在進行手術造模前幾天連續每天給予藥物處理，然后再進行手術造模以及后續指標檢測，但是在臨床實踐中，心肌缺血再灌注的發生是隨機且突然的，無法預判，因此急需尋找治療藥物并非預防藥物，而本實驗是基于缺血后再灌注前進行治療性的給藥，具有一定的研究價值和意義。

MI/RI的發病是一個復雜的病理過程，其機制還不完全明確。細胞焦亡也是一個新的細胞程序性死亡形式，其中的NLRP3炎癥小體的介導途徑很多，例如TLR4/NF-kB途徑［24］和ROS途徑［25］等。本研究結果顯示，柚皮苷可以顯著減輕大鼠MI/RI，其機制可能與細胞焦亡有關，但是關于柚皮苷是通過何種途徑的介導來抑制細胞焦亡的機制還不清楚，有待進一步的研究驗證。