低氧環境運動對營養性肥胖大鼠心肌細胞自噬相關蛋白表達的影響*

彭燕群，陳珍珍，翁錫全，林文弢△

（1廣州體育學院，廣東廣州510500；2廣東東軟學院，廣東佛山528225）

細胞自噬（autophagy）是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性降解途徑，參與機體發育和分化等全過程，是將細胞內變性、衰老或損傷的蛋白質和細胞器轉運到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過程［1］。正常情況下，細胞自噬是生物體為了對抗外界壓力而實現自我保護的一種機制。據現有研究報道，運動、營養和環境等因素均可誘導細胞自噬［2-3］。由此，低氧作為典型應激環境之一，對機體細胞自噬具有重要影響作用。研究發現，低氧可以誘導線粒體自噬，其中低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible fac‐tion-1α，HIF-1α）為關鍵因子，HIF-1α依賴性的BNIP3蛋白通過激活beclin-1，達到激活線粒體自噬的效果［4］。此外，相關研究發現，低氧環境結合運動干預，可誘導骨骼肌細胞自噬［5］。然而，關于細胞自噬的研究，多集中于骨骼肌細胞自噬和骨骼肌線粒體自噬，對于心肌細胞自噬的研究較少，且多集中于疾病引起的細胞自噬，而對于運動、低氧環境與心肌細胞自噬間的關系，鮮有報道。

本研究通過構建營養性肥胖大鼠模型，對其進行低氧環境運動干預，探討低氧環境運動對肥胖大鼠心肌細胞自噬相關關鍵因子微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1、p62及能量調節因子腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMP-activated protein kinaseα2，AMPKα2）等的影響，進而探討低氧環境運動對心肌細胞自噬的影響，為低氧環境運動改善機體形態和促進心肌組織的保護功能提供實驗依據。

材料和方法

1 動物和細胞

1.1 構建營養性肥胖大鼠模型 健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠100只，體重為170～220 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2011-0015。大鼠常規分籠（每籠5只）飼養，適應性飼養1周，隨機分為：普通飼料（control，C）組（國家標準嚙齒類動物飼料飼養）和高脂飼料（high-fat diet，H）組［高脂飼料成分：蔗糖20%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%，酪蛋白10%，磷酸氫鈣0.6%，石粉0.4%，預混料0.4%，基礎飼料52.2%；供能比：蛋白質17.5%，脂肪37%，碳水化合物45.5%（均為質量分數）；購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2013-0002］。自然光照周期，室溫：21℃～25℃，相對濕度：40%～60%，自由飲食和飲水。本實驗嚴格按照實驗動物飼養和動物實驗福利倫理原則要求進行實驗。持續性喂養7周后，從C組和H組分別隨機挑選10只和18只，取血，測大鼠血脂指標，并結合體重和Lee指數，評估肥胖大鼠模型造模效果，數據顯示營養性肥胖大鼠造模成功［6］。

1.2 實驗動物分組 營養性肥胖大鼠建模成功后，從H組選取60只肥胖大鼠隨機分為常氧對照（nor‐moxic control，NC）組、16.3%低氧環境安靜（16.3%hypoxia quiet，HC1）組、13.3%低 氧 環 境 安 靜（13.3%hypoxia quiet，HC2）組、常氧運動（normoxic exercise，NE）組、16.3%低氧環境運動（16.3%hy‐poxic environmental exercise，HE1）組和13.3%低氧環境運動組（13.3%hypoxic environmental exercise，HE2）組6組，每組10只，各組均維持高脂膳食喂養。本實驗低氧組采用Hypoxico公司生產的低氧分壓系統（HTS），模擬人工常壓低氧環境。低氧安靜組即在低氧（氧濃度分別為16.3%和13.3%）環境下，連續進行12 h低氧暴露干預，而無其他條件干預；低氧運動組即在低氧環境下，連續進行12 h低氧暴露干預，同時進行以下運動方案干預。運動組大鼠預先進行1周跑臺適應性訓練，正式訓練時NC組大鼠不進行其他干預，HC1組和HC2組分別給予氧濃度為16.3%和13.3%的低氧環境暴露，NE組大鼠為常氧耐力訓練，HE1組和HE2組大鼠分別給予氧濃度為16.3%和13.3%的低氧環境暴露并增加耐力運動訓練。正式訓練方案：跑速為20 m/min，運動持續時間40 min/d，跑臺坡度0°，每周5次，持續8周。末次訓練后禁食24 h后，稱量大鼠體重并測體長，處死后取出心臟并稱重，另剪切一部分心尖組織分置凍存管于液氮中速凍，?70℃超低溫冰箱保存，待測。

2 主要試劑

抗AMPKα2抗體（貨號ab3760）購于Abcam；抗beclin-1抗體（貨號3495）、抗LC3抗體（貨號4108）、抗p62抗體（貨號5114）和辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG購于Cell Signaling Technology；內參照GAPDH抗體購于Abcam/杭州賢至公司；5%脫脂奶粉購于BD；Western及IP細胞裂解液購于碧云天；Pierce ECL化學發光液購于Thermo Scientific。

3 主要方法

3.2 Western blot檢測 取心肌組織50 mg于冰上剪碎入研缽中，按照Western及IP細胞裂解液說明書加入500μL RIPA蛋白裂解液和5μL PMSF蛋白酶抑制劑的混合液，研碎后轉入離心管，在低溫離心機14 000 r/min離心10 min，取上清液備用。BCA法測定蛋白濃度。15%和12%SDS-PAGE分離AMPKα2、beclin-1、LC3和p62后，濕轉法轉于PVDF膜上，封閉2 h后，Ⅰ抗稀釋比例1∶1 000，4℃過夜，以GADPH為內參照。TBST緩沖液洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，稀釋比例為1∶3 000，室溫下搖床緩慢搖2 h。TBST液室溫搖床洗3次，將洗過的膜正面朝上移到保鮮膜上于暗盒滴加化學發光液A液和B液以等體積，把X光片放在膜上，關上暗盒、曝光、顯影、定影，用ImageJ軟件進行灰度值分析。

4 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計。結果用均數±標準差（mean±SD）表示。GraphPad Prism 5進行數理統計及圖像生成。采取運動與低氧環境干預時，以運動和氧濃度作為影響因素，進行兩因素（2×3）方差分析，分析每個因素的主效應以及兩因素間的交互作用。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 低氧環境運動干預對營養性肥胖大鼠形態及心臟重量指數的影響

由表1可知，低氧環境暴露或結合耐力運動干預后，與NC組和HC1組相比，NE、HE1和HE2組大鼠體重均顯著降低（P<0.05），NE、HE1和HE2組大鼠Lee指數也均顯著降低（P<0.05）；各組大鼠體長無顯著差異（P>0.05）；與NC組相比，HC1和HC2組大鼠心臟重量指數無顯著差異，而NE、HE1和HE2組大鼠心臟重量指數顯著升高（P<0.05），且HE2組顯著高于其他各組（P<0.05）。

表1 低氧環境運動干預后肥胖大鼠形態及心臟重量指數的變化Table 1.Changes of the body shape（Lee index）and heart weight index in obese rats after intervention of hypoxic environmental exer‐cise（Mean±SD.n=6）

2 低氧環境運動對營養性肥胖大鼠心肌AMPKα 2、beclin-1、LC3和p62蛋白雙因素方差分析結果

表2結果顯示，耐力運動對肥胖大鼠心肌AMPKα2表達有顯著影響（P<0.05），表明耐力運動能顯著增強肥胖大鼠心肌AMPKα2的表達；耐力運動和氧濃度對肥胖大鼠心肌beclin-1蛋白表達有顯著影響（P<0.05），表明低氧環境或耐力運動均能顯著增強肥胖大鼠心肌beclin-1蛋白的表達；氧濃度對肥胖大鼠心肌LC3蛋白表達有顯著影響（P<0.05），表明低氧環境能顯著增強肥胖大鼠心肌LC3蛋白的表達；耐力運動和氧濃度對肥胖大鼠心肌p62蛋白表達有顯著影響（P<0.05），表明低氧環境或耐力運動均能顯著下調肥胖大鼠心肌p62蛋白的表達。

表2 低氧環境運動干預后營養性肥胖大鼠心肌AMPKα2、beclin-1、LC3和p62蛋白的雙因素方差分析結果Table 2.Results of two-factor ANOVA of AMPKα2，beclin-1，LC3 and p62 in myocardium of nutritionally obese rats after hypoxic environmental exercise intervention

3 低氧環境運動對營養性肥胖大鼠心肌AMPKα2蛋白的影響

如圖1所示，低氧環境暴露或結合耐力運動干預后，與NC組相比，HC1和HC2組大鼠心肌AMPKα 2蛋白表達無顯著差異，NE和HE1組大鼠心肌AMPKα2蛋白表達量顯著下降（P<0.05），而HE2組顯著升高（P<0.05），HE2組大鼠心肌AMPKα2蛋白表達顯著高于其他各組（P<0.05）。

Figure 1.The expression of AMPKα2 in myocardium of rats in hypoxia exercise intervention group.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs NC group；#P<0.05 vs NE group；△P<0.05 vs HE1 group.圖1 低氧環境運動干預各組大鼠心肌AMPKα2蛋白的表達

4 低氧環境運動對營養性肥胖大鼠心肌beclin-1、LC3和p62蛋白的影響

如圖2所示，與NC組相比，HC2、HE1和HE2組beclin-1蛋白表達顯著升高（P<0.05），HE1和HE2組beclin-1蛋白表達顯著高于NE組（P<0.05）；與NC組相比，其他各組LC3-II/LC3-I比值均顯著升高（P<0.05），HE1和HE2組LC3-II/LC3-I比值顯著高于HC1組（P<0.05），HE2組LC3-II/LC3-I比值顯著高于NE組（P<0.05）；與NC組相比，其他各組p62蛋白表達顯著低于該組（P<0.05）。

討 論

1 低氧環境運動對營養性肥胖大鼠形態及心臟重量指數的影響

目前關于低氧運動對肥胖影響多見于與體重和血液相關指標的研究，而對心臟功能和自噬分子機制水平研究較少。我們前期研究曾分別采取15.4%和14.5%低氧或結合耐力運動的干預手段［7-8］，實驗發現兩種濃度低氧或結合耐力運動均可有效改善大鼠體重及血糖血脂，為探討更多不同濃度低氧對大鼠機體形態學、心臟功能及調控心肌氧化代謝相關指標的影響，因而本研究選擇13.3%（海拔高度3 600 m）和16.3%（海拔高度2 000 m）兩種濃度低氧，分別進行低氧或/和耐力運動干預。8周低氧環境暴露或/和耐力運動干預抑制大鼠體重增長效果明顯，其中低氧環境運動干預效果最佳，且13.3%低氧環境運動干預效果優于16.3%低氧環境運動干預，表明低氧環境及運動干預均抑制大鼠體重增長，且兩者具有協同作用；兩組低氧環境安靜組大鼠體重雖無統計學差異性，但低于常氧安靜組，由此表明低氧環境暴露也具有降低體重作用效果，然而效果不顯著，這可能由于持續低氧環境暴露對動物體重的影響具有時間依從性［9］。另外，Lee指數是反映大鼠肥胖程度的重要指標［10］。實驗結果發現，低氧環境或（和）耐力運動可有效降低肥胖大鼠Lee指數，表明低氧環境或耐力運動可減輕肥胖大鼠的肥胖度，其中，運動對大鼠Lee指數影響更為顯著。此外，心臟重量指數是評價心臟功能的重要指標之一［11］。耐力訓練可引起心肌生理性肥大，運動主要引起心室肥大。蔡明春等［12］研究表明，在模擬高原條件下，缺氧復合適當的運動后，可以引起心室體重增加。本研究結果顯示，低氧環境運動干預后，大鼠心臟重量指數均顯著高于對照組，而兩組低氧環境暴露組大鼠的心臟重量指數則與對照組并無統計學差異，但高于對照組，由此表明低氧環境暴露或（和）耐力運動可顯著性引起心室體重增加和心臟重量指數的增加，表明低氧環境耐力運動可使肥胖大鼠心肌產生適應性變化，促進了心臟功能的改善，這與蔡明春等［12］的研究結果一致。

Figure 2.Changes of beclin-1，LC3 and p62 expression in myo‐cardium of rats after hypoxic environmental exercise intervention.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs NCgroup；#P<0.05 vs NEgroup；△P<0.05 vs HC1 group.圖2 低氧環境運動干預后各組大鼠心肌beclin-1、LC3和p62蛋白的表達變化

2 低氧環境運動對營養性肥胖大鼠心肌細胞AMPKα2蛋白表達的影響

AMPK作為機體能量感受器，是調控能量穩態的重要蛋白激酶之一，AMPK蛋白激酶含有多種亞單位，包括α、β和γ三種，其中在心肌中表達較高的是AMPKα2。AMPKα2與糖脂能量代謝密切相關。Villena等［13］高脂飼養AMPKα2基因敲除的小鼠13周，發現AMPKα2敲除小鼠機體的脂肪重量和體重均顯著性增加，表明AMPKα2敲除會引起機體肥胖，提示AMPKα2活化對調節機體肥胖程度起著重要影響作用。在不同環境應激下，例如運動、富營養化、熱環境、低氧環境等，均會促使AMPK活化，進而激活下游信號通路，調節體內能量代謝。

間歇低氧環境對心臟組織的保護作用毋庸置疑，但其機制尚未闡明。低氧環境下心臟組織為能夠更經濟地工作，心肌組織在產生、利用能量方面會出現一系列的適應性變化，以維持心肌細胞的能量平衡，從而起到保護心臟的作用。同時，低氧環境下心肌組織為適應機體氧的需要，心肌細胞通過提高氧合能力保護心臟功能。心肌是機體需氧量高而對缺氧較敏感的組織之一。由此，低氧可能引起心肌AMPKα2蛋白表達發生變化。運動也可以活化機體的AMPK，耐力運動訓練會促使心肌AMPKα2蛋白表達水平增加［14］。楊赟等［15］采用一次性11.8%低氧環境耐力運動和低氧環境力竭運動干預，發現低氧環境耐力運動并未激活AMPKα2蛋白表達，而低氧環境力竭運動則激活了AMPKα2蛋白表達。文獻檢索發現低氧環境下，對于心肌AMPKα2蛋白變化的研究較少，且無一致性結論。本實驗結果顯示，暴露組心肌組織后AMPKα2蛋白表達量均有所增加，且隨著低氧環境下濃度下降，心肌組織AMPKα2蛋白表達量隨之增強，可能由于低氧環境刺激AMPK酶活性升高，為心肌細胞能量代謝滿足心臟供能提高酶活性，進而達到能量平衡穩態。但常氧運動和16.3%低氧運動大鼠心肌組織AMPKα2蛋白表達量則低于安靜組，這與前人研究運動［16］或低氧運動［17］均能激活心肌AMPKα2活性不一致，其原因是否與心肌組織糖原含量或心臟功能有關，有待進一步研究。僅有13.3%低氧運動組心肌組織AMPKα2蛋白表達量顯著性高于安靜組，推測低氧環境下的耐力運動，對心肌組織AMPKα2蛋白表達量的刺激存在一定閾值，或因低氧濃度對心肌組織AMPKα2蛋白表達量存在閾值，其機制有待進一步研究。

此外，另有研究發現，AMPKα2蛋白不僅參與了細胞的傳感和能量調控，且在細胞自噬作用方面也扮演重要角色［18］，可能是因為運動開始后隨著的ATP消耗，啟動AMPK以彌補低能量狀態，此時可激活自噬機制［19］。劉超［20］對小鼠進行4周10%氧氣濃度的低氧環境干預，構建缺氧小鼠模型，發現常氧環境下，AMPKα2敲除小鼠心肌細胞自噬水平并無明顯變化，而在低氧環境下，AMPKα2敲除小鼠心肌細胞自噬水平顯著降低，由此提示AMPKα2所介導的自噬可能在心肌慢性缺氧的適應中具有重要意義。Zhang等［21］的研究中也顯示，AMPK參與了心肌細胞線粒體自噬的調控，低氧環境下對心臟保護發揮重要作用，這可為與慢性缺氧相關的心臟病提供了一個潛在治療靶點。本實驗結果顯示，13.3%低氧環境耐力運動組心肌細胞AMPKα2蛋白的表達顯著升高，說明低氧環境和耐力運動影響機體AMPK表達也存在不同效果，低氧環境和耐力運動引起AMPKα 2蛋白表達的增多可能有疊加效應，且運動的疊加效應更突出。8周常氧耐力運動、低氧環境暴露或低氧環境運動干預后，大鼠心肌AMPK磷酸化蛋白表達量均有所提高，且低氧環境運動干預后AMPK磷酸化程度更加顯著，表明在低氧環境、運動和低氧環境結合運動三種干預方式中，低氧環境結合運動干預對大鼠心肌AMPK的活化作用效果最強，這與我們的研究假設相符。然而我們在比較低氧環境、運動兩因素對AMPK的影響作用時，發現運動對AMPK磷酸化作用更顯著，兩者疊加時則無統計學意義，由此我們推測低氧環境下運動時，可能會存在其他細胞分子活化通路，進而影響AMPK磷酸化水平，仍需進一步闡明。

3 低氧環境耐力運動對營養性肥胖大鼠心肌細胞自噬相關蛋白beclin-1、LC3和p62蛋白表達的影響

在運動、環境刺激和營養等應激下，細胞自噬過程可將胞漿中損傷或衰老的細胞組件（線粒體、內質網和核糖體）、病菌和ROS等代謝廢物，以及糖原、脂質、非功能或功能性蛋白質等能源物質，轉運到溶酶體中消化降解，從而完善細胞質量控制，有效供給細胞更新和代謝平衡所需的能量與合成底物。運動訓練不僅能通過細胞自噬完善機體能量代謝穩態，還能有效防治肥胖、II型糖尿病等代謝疾病發生。運動是激活細胞自噬的重要誘因之一，Levine等［22］認為運動可以有效誘發細胞自噬，且一次急性運動和耐力運動均可使具有正常自噬能力小鼠糖代謝能力增加，自噬相關蛋白表達也增加，而該情況在自噬缺陷小鼠體內并不會發生。細胞自噬在心肌缺血-再灌注、心肌梗死等心血管疾病發生中起著重要作用，研究顯示HIF-1在心肌細胞的缺氧適應性反應中起著核心作用，可誘導細胞自噬。由此可知，低氧環境可影響細胞自噬發生［23］。beclin-1是細胞自噬重要參與分子之一，也是參與調控自噬體形成的關鍵因子之一，有研究表明beclin-1活性表現與低氧應激密切相關［24-25］。因此，通過測定心肌組織beclin-1蛋白表達，則可在一定程度上能反映心肌細胞自噬水平。本研究結果顯示，低氧環境暴露或/和耐力運動均可上調beclin-1蛋白表達，由此提示低氧環境、運動兩因素均與心肌細胞自噬相關，并與其他學者研究結果一致［26］。此外，本實驗結果也發現，相較于單純低氧環境暴露刺激而言，低氧環境運動可更有效刺激beclin-1蛋白的表達。由上述可知，低氧環境與耐力運動兩種刺激均可提高心肌組織beclin-1蛋白表達量，進而促使心肌組織細胞自噬活性增強，從而利于維持細胞內環境能量穩態。此外，13.3%低氧環境運動組的beclin-1蛋白表達量更高，由此表明低氧環境和耐力運動對心肌組織細胞自噬蛋白分子表達的誘導具有累積效應，且與低氧濃度可能存在正相關。而我們在比較低氧環境、運動兩因素對beclin-1蛋白的影響作用時，發現兩者對beclin-1蛋白的影響作用均具有顯著性統計學意義，顯示低氧環境或運動兩因素對beclin-1蛋白均具有顯著性影響作用。

除了beclin-1蛋白外，LC3-II也被認為細胞自噬的特異性標志物之一，通常用LC3-II/LC3-I的比值來衡量自噬活性，其比值下降提示自噬活性減弱，反之則說明自噬活性增強［27］。還有自噬底物蛋白p62，在多種細胞和組織都有表達，與自噬活性負相關，可間接反映自噬活性。馬曉雯等［28］研究發現，中等強度訓練組和大強度訓練組beclin-1表達水平及LC3-II/LC3-I比值均顯著升高，且大強度訓練組顯著高于中等強度訓練組，提示中等強度耐力訓練可引起心肌組織細胞良好適應性重塑，促進心肌細胞適當自噬水平及活性，從而有效上調beclin-1和LC3的表達，提高LC3-II/LC3-I比值，增強心肌細胞代謝能力，有利于心肌能量代謝和收縮功能。崔迪等［29］通過對肥胖小鼠進行6周耐力運動干預，發現運動組小鼠骨骼肌LC3-II/LC3-I比值上調，p62蛋白表達下降，表明運動對LC3-II/LC3-I及p62蛋白表達具有顯著影響作用。除運動因素外，低氧環境對LC3-II/LC3-I及p62蛋白表達也具有顯著影響作用［3，30］。本實驗結果顯示，13.3%低氧環境運動組大鼠心肌LC3的蛋白表達均顯著高于其他組，提示可能是低氧環境促進LC3表達量增加，并且促進LC3-I向LC3-II轉化。在比較低氧環境、運動兩因素對LC3蛋白的影響作用時，發現僅低氧環境因素對LC3蛋白的影響作用具有顯著性統計學意義，由此可知低氧環境對LC3蛋白具有顯著性影響作用。

與此同時，13.3%低氧環境運動組大鼠心肌p62蛋白的表達量顯著性降低，由以上結果可知低氧環境耐力運動可增強細胞自噬相關蛋白的表達，進而誘導心肌組織細胞自噬增強。而對于p62蛋白而言，比較低氧環境、運動兩因素對p62蛋白的影響作用時，發現兩者對p62蛋白的影響作用均具有顯著性統計學意義，由此可知低氧環境或運動兩因素對p62蛋白均具有顯著性影響作用。由上可知，低氧環境運動可以上調心肌組織LC3蛋白表達，促進LC3-I型向LC-3II型轉化，下調p62蛋白表達，且具有累積效應，由此表明適量低氧環境運動可有效地上調心肌細胞自噬水平，保護心臟。但目前國內外有關運動訓練或低氧運動訓練對細胞自噬研究并不多，因此其分子機制還存在諸多問題亟待解決。

綜上所述，低氧環境運動可改善營養性肥胖大鼠的形態，提高心臟重量指數。低氧環境或（和）運動均可上調beclin-1和LC3蛋白表達，下調p62蛋白表達，增強心肌細胞自噬水平，有利于提高心肌細胞的保護功能，其中適度低氧環境運動作用效果更為顯著，并可能成為新的治療靶點。