MIF通過調控ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路影響瘢痕成纖維細胞活力和凋亡*

李鵬程，向雪寶，何 楠，吳振江，靳三丁△

（1鄭州大學附屬兒童醫院燒傷整形科，河南鄭州450000；2廣西醫科大學基因組學與個體化醫學研究中心，廣西南寧530000；3鄭州大學附屬兒童醫院病理科，河南鄭州450000；4河南省胸科醫院胸外科，河南鄭州450000）

病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，是臨床中最常見的真皮纖維增生性疾病，典型的病理特征為成纖維細胞異常增殖及膠原蛋白過度沉積等，尤以瘢痕疙瘩為著，其可伴有瘙癢、疼痛、瘢痕攣縮致功能障礙，甚至反復破潰而引起惡變等，嚴重影響患者生活質量，應采取積極治療措施［1］。目前常用的治療方法有局部用藥、壓迫治療、激光、手術及放射治療等，但尚未找到單一滿意療效的方法，綜合治療仍為臨床首選。又因病理性瘢痕與人種、遺傳因素、血型和膚色等關系密切，提示基因治療具有重要意義。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migra‐tion inhibitory factor，MIF）屬多功能細胞因子，具有促炎、免疫調節、促進細胞增殖、轉移和促組織纖維化等多種功效［2］，在病理性瘢痕中表達升高，可以促進成纖維細胞增殖等，進而加重疾病［3］。細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated pro‐tein kinase，MAPK）通路在畸變中發揮核心作用，通過影響細胞凋亡實現對腫瘤的調控［4］；轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）與病理性瘢痕關系密切，影響細胞的增殖、分化及凋亡，可介導Sma和Mad相關蛋白（Sma-and Mad-related pro‐teins，Smads）家族，調控靶基因發揮作用［5］。在病理性瘢痕中黏結蛋白聚糖1（syndecan-1）可以通過調控ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路發揮作用［6］。而MIF是否通過ERK/MAPK及TGF-β1/Smads通路影響病理性瘢痕，目前尚不清楚。因此，本研究收集瘢痕疙瘩樣本并提取成纖維細胞，過表達/干擾MIF后觀察其對成纖維細胞生物學行為的影響，探討其相關機制，以期為病理性瘢痕的基因治療提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象 收集鄭州大學附屬兒童醫院燒傷整形科與河南省胸科醫院胸外科手術切除的瘢痕疙瘩組織，同時收集正常皮膚組織（來源于同一患者的正常皮膚組織），共6例，其中男2例，女4例，年齡18～29歲。本研究經醫院倫理委員會審核并批準。樣本收集前患者或監護人均知情和同意該研究，并簽署知情同意書。

瘢痕疙瘩診斷標準：（1）腫塊隆起于皮膚表面，堅硬，表面光滑發亮，界限欠規則，1年內無退宿跡象；（2）病變超過原始損傷邊緣，向周圍正常組織發生浸潤，蟹足狀生長；（3）具有持續性生長、發紅、疼痛、瘙癢等癥狀；（4）病理學檢查證實瘢痕疙瘩組織內有膠原及基質成分的大量沉積，成纖維細胞增多，并有分裂相。納入標準：（1）符合上述瘢痕疙瘩診斷標準；（2）未使用瘢痕抑制藥物；（3）局部未行除常規切除術以外的其他治療。排除標準：（1）伴有其他嚴重疾病者；（2）妊娠期或哺乳期女性；（3）病灶處存在嚴重的潰瘍、感染等皮膚外觀異常者。

1.2 試劑與儀器 LipofectamineTM2000、p-EGFPN1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIFsiRNA均購自廣州銳博生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；MTT試劑盒及抗MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、p38 MAPK和磷酸化p-p38 MAPK（phosphory‐lated p38 MAPK，p-p38 MAPK）抗體（Abcam）。CO2培養箱（北京金洋萬達科技有限公司，型號CJ25-200L）；實 時 熒 光 定 量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）儀（ABI，型號7500）；流式細胞儀（Thermo Fisher Scientific，型號CytoFLEX）；沖片機（北京京晶科技有限公司，型號TH-25）。

2 方法

2.1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF mRNA水平的檢測 RT-qPCR引物由軟件Primer Premier 5.0設計，MIF的上游引物序列為5'-GTTCCTCTCC‐GAGCTCACC-3'、下游引物序列為5'-TGCTGTAC‐CACGCCTTCTG-3'（產物長度為180 bp）；GAPDH的上游引物序列為5'-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-GCCTGCTTCAC‐CACCTTCTTG-3'（產物長度為269 bp）。每組取樣5 mg，Trizol提取總RNA，將RNA逆轉錄成cDNA。RTqPCR儀檢測細胞中MIF mRNA水平，反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s、61℃（MIF）或60℃（GAPDH）退火45 s、72℃延伸30 s，40個循環。2?ΔΔCt法計算MIFmRNA相對表達水平。

2.2 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF蛋白水平的檢測 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織各取5 mg組織，手術剪剪碎后添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，4℃、10 000 r/min離心20 min，上清為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每泳道上樣量30μg，SDSPAGE，低電壓轉膜過夜，10%脫脂奶粉封閉液封閉PVDF膜1 h，添加對應I抗MIF于4℃孵育過夜。HRP標記的IgG孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化學發光后X光片曝光，沖片機沖片。圖像分析軟件分析X光膠片上蛋白條帶灰度，計算出檢測基因與內參的比值。

2.3 樣本收集與細胞分離、培養瘢痕疙瘩組織 利用組織塊培養法從瘢痕疙瘩組織樣本中提取成纖維細胞。去除組織皮下組織，將組織切成2 mm×2 mm×2 mm左右的方塊，置于6孔板中央，樣本上方覆蓋22 mm蓋玻片，置于37℃、CO2培養箱中培養6～8 h，細胞牢牢地貼壁在培養皿中時，添加含15%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養細胞，每天觀察細胞狀態，3 d換液1次。待細胞長成單層時，0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代，10%胎牛血清DMEM培養液培養細胞，細胞2～3 d更換一次培養液，4～5 d傳代1次，細胞傳至3代，顯微鏡下觀察細胞狀態。本研究細胞傳代6～8代進行實驗。

2.4 細胞分組及處理 實驗分為對照（control）組、空載體組（empty vector，EV）組、MIF過表達組（MIFover-expression，MIF OE）組、陰性對照組（siRNA NC組）和MIF干擾組（si-MIF組）。細胞轉染前1 d，對成纖維細胞消化、傳代，每孔4×105個接種至6孔板中置于37℃、CO2培養箱中培養，待細胞密度>85%時，更換為無血清的DMEM培養液繼續培養12 h，空載體組、MIF過表達組、陰性對照組和MIF干擾組均用li‐pofectamineTM2000分別轉染p-EGFP-N1、p-EGFP-N1-MIF、siRNA NC和MIFsiRNA 4μg，置于37℃、CO2培養箱中轉染6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。

2.5 RT-qPCR檢測細胞中MIF的mRNA水平 各組細胞繼續培養48 h后，參考2.1中方法檢測細胞中MIF的mRNA水平。

2.6 MTT實驗檢測細胞活力 以每孔1×104個接種至96孔板，含10%胎牛血清的DMEM培養液分別培養12、24、48、72和96 h，MTT法測定490 nm處的吸光度（A），計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 每孔4×105個接種至6孔板中，含10%胎牛血清的DMEM培養液培養48 h后胰蛋白酶消化處理并離心，各組細胞各取5×105個于1.5 mL EP管中，每管加入500μL結合緩沖液懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC及10μL PI混勻并室溫避光放置約20 min，然后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.8 Western blot法檢測細胞中MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白水平 每孔4×105個接種至6孔板中，含10%胎牛血清的DMEM培養液培養48 h后胰蛋白酶消化細胞，細胞收集至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，添加200μL蛋白裂解液，冰上裂解細胞20 min，4℃、10 000 r/min離心20 min，上清為總蛋白，參考2.2中蛋白檢測方法檢測細胞中MIF、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白水平。

Figure 1.The mRNA（A）and protein（B and C）levels of MIF in keloid tissue and normal skin tissue.1 to 6：each sample.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs normal skin tissue.圖1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF的mRNA和蛋白水平

3 統計學處理

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中MIF的mRNA和蛋白水平情況

與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織中MIF的mRNA和蛋白水平升高（P<0.05），見圖1。

2 成纖維細胞的分離、培養與傳代結果

顯微鏡下觀察第3代細胞，可見細胞形態均一，長梭形、片簇狀排列，見圖2。

3 MIF轉染細胞情況的驗證結果

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞中MIF的mRNA和蛋白水平顯著升高（P<0.05），MIF干擾組細胞中MIF的mRNA和蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

4 MIF對細胞活力的影響

轉染12 h，分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞活力顯著升高（P<0.05）；處理24、48、72和96 h，分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理12 h相比，處理24、48、72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理24 h相比，處理48、72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05）；與處理48 h相比，處理72和96 h后MIF過表達組的細胞活力顯著升高（P<0.05），MIF干擾組的細胞活力顯著降低（P<0.05），見圖4。

Figure 2.The morphological change of scar fibroblasts observed under microscope（scale bar=200μm）.圖2 顯微鏡下觀察瘢瘢成纖維細胞形態

Figure 3.The mRNA（A）and protein（B and C）expression of MIF in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖3 瘢瘢成纖維細胞中MIF的mRNA和蛋白表達情況

5 MIF對細胞凋亡的影響

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組的細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），MIF干擾組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），見圖5。

6 MIF對細胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白水平的影響

分別與對照組、空載體組和陰性對照組相比，MIF過表達組細胞中Bax、cleaved caspase-3和Smad7的蛋白水平顯著降低（P<0.05），Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平顯著升高（P<0.05），MIF干擾組細胞中Bax、cleaved caspase-3和Smad7的蛋白水平顯著升高（P<0.05），Bcl-2、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白水平顯著降低（P<0.05），見圖6～8。

討 論

Figure 4.Effects of MIF treatment for 12，24，48，72 and 96 h on the viability of the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；△P<0.05 vs siRNA NC group；a P<0.05 vs 12 h；b P<0.05 vs24 h；c P<0.05 vs48 h.圖4 MIF處理12、24、48、72和96 h對瘢瘢成纖維細胞活力的影響

Figure 5.The effect of MIF on the apoptosis of the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖5 MIF對瘢瘢成纖維細胞凋亡的影響

Figure 6.Effects of MIFon apoptosis-related proteins Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs overexp MIFgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖6 MIF對瘢瘢成纖維細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的影響

病理性瘢痕常見致病因素包括創傷、燒傷、手術、皮膚穿刺、疫苗接種及痤瘡等，其形成過程不僅涉及成纖維細胞異常增殖及膠原的過度沉積，還與較低的凋亡率有關。延長成纖維細胞周期、抑制生長、促進細胞凋亡、阻止成纖維細胞表型轉化等方式可減少細胞纖維化形成，成為治療病理性瘢痕的關鍵［7-8］，故本文以瘢痕成纖維細胞為研究對象。隨著研究的不斷深入，以及基因技術在臨床上的應用廣泛，基因療法可以從根本上對病理性瘢痕進行干預。在本研究中，我們發現MIF的mRNA和蛋白水平在瘢痕疙瘩組織中高表達，接著過表達或沉默MIF的表達，探討其在病理性瘢痕治療中的應用價值，為臨床上病理性瘢痕的治療提供實驗依據。

Figure 7.Effects of MIF on the protein levels of TGF-β1/Smads signaling pathway-related molecules TGF-β1，Smad2，Smad3 and Smad7 in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIF OE group；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖7 MIF對瘢瘢成纖維細胞中TGF-β1/Smads通路相關蛋白TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7的影響

MIF在先天免疫防御中發揮重要作用，當外源性細菌等可刺激白細胞釋放MIF進入血液，MIF結合其他免疫細胞引發急性免疫功能［9］。在外源刺激下機體為恢復其功能，升高MIF的表達發揮免疫功能。MIF在肺纖維化中表達升高，在成纖維細胞增殖、膠原合成以及器官纖維化過程中發揮重要作用［10］；MIF通過下游多種信號通路發揮作用，MIF在病理性瘢痕中表達升高，一方面MIF能夠抑制抑癌基因P53的功能和促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤的發生與發展，另一方面其能夠激活MAPK家族從而促進腫瘤增殖［11］。MIF過表達可通過促炎癥反應環節誘導腫瘤壞死因子α的生成，腫瘤壞死因子α能有效誘導TGF-β1表達，TGF-β1作為腫瘤促進因子，可促進腫瘤細胞無限增殖［12］。MIF通過CD74/CD44受體復合物介導ERK通路，促進ERK通路活化，ERK通路是MAPK中經典通路，在細胞增殖、分化和凋亡等多種病理生理過程中發揮重要作用，活化的ERK可以避免細胞凋亡，并促進細胞周期進展［13］。TGF-β1在病理性瘢痕中高表達，被認為與傷口愈合關系密切，能夠促進纖維化和瘢痕形成；作為瘢痕疙瘩的關鍵致病因子，能夠刺激纖維細胞大量增殖及膠原、彈力蛋白的合成［14］；同時與細胞凋亡關系密切，是組織損傷的上調基因，作用貫穿傷口愈合始終。Smads蛋白家族在TGF-β1超家族信號轉導中發揮作用，Smad2和Smad3屬TGF-β1受體調節型蛋白，活化的Smad2、Smad3與TGF-β1的表達趨勢類似，能夠形成低聚物與膠原啟動基因集合，調節瘢痕的形成；Smad7屬拮抗型蛋白，能夠拮抗這一過程，形成負反饋，抑制上述過程［15-16］。TGF-β1/Smads通路與細胞凋亡關系密切，參與腫瘤細胞的增殖和凋亡等過程［17］。在本研究中，過表達MIF后，細胞中Smad7蛋白水平降低，TGF-β1、Smad2、Smad3、p-ERK和p-p38 MAPK蛋白水平升高，提示過表達MIF后可以激活ERK/MAPK通路，活化TGF-β1促進Smad2和Smad3的表達，抑制Smad7的表達，從而促進病理性瘢痕的形成；而干擾MIF表達后可抑制上述過程，從而降低p-ERK、pp38 MAPK、TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表達，促進Smad7的蛋白表達，實現對疾病的保護，為臨床上MIF抑制劑、MIF干擾劑或敲除MIF用于治療病理性瘢痕提供了可能，但具體機制有待進一步研究。

Figure 8.Effects of MIF on ERK/MAPK pathway-related proteins in the scar fibroblasts.Mean±SD.n=6.#P<0.05 vs control group；*P<0.05 vs EV group；&P<0.05 vs MIFOEgroup；△P<0.05 vs siRNA NCgroup.圖8 MIF對瘢瘢成纖維細胞中ERK/MAPK通路相關蛋白的影響

在病理性瘢痕中，成纖維細胞過度增殖是導致瘢痕形成的主要環節，多種凋亡抑制基因以及促凋亡基因參與成纖維細胞增殖和凋亡過程，Bax和Bcl-2均作為Bcl-2家族成員，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2能夠抑制凋亡，二者相互作用影響細胞凋亡過程［18］。caspase-3作為凋亡調控因子，活化的cleaved cas‐pase-3能夠啟動激酶級聯反應，從而促進細胞凋亡［19］。在病理性瘢痕中細胞凋亡基因受到抑制，細胞調控周期變短，促進細胞增生，促進瘢痕形成［20］。本研究發現，過表達MIF后，細胞活力升高，凋亡率降低，細胞中促凋亡蛋白Bax和凋亡調控蛋白cas‐pase-3表達量降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達量升高，提示在病理性瘢痕中MIF處于高水平狀態，MIF通過激活ERK/MAPK通路促進TGF-β1表達，提高細胞活力，抑制細胞凋亡，參與瘢痕形成。干擾MIF后，細胞存活率降低、凋亡率升高，促凋亡蛋白表達升高，促進成纖維細胞凋亡，減少瘢痕的發生。

綜上所述，沉默MIF可抑制病理性瘢痕ERK/MAPK及TGF-β1/Smad2/3通路中相關因子的表達，進而促進細胞凋亡，抑制成纖維細胞過度生長，為臨床治療病理性瘢痕基因治療提供新的策略，相關結論有待于更大樣本的研究來進一步證實。另外，鑒于病理性瘢痕發病機制復雜，與細胞周期、細胞遷移等多種過程關系密切，發現更多與MIF有關的機制是接下來的研究重點。