晚期糖基化終產(chǎn)物及其胞膜受體在口腔領(lǐng)域的研究進(jìn)展*

鄧涵丹，張 嵐，劉 瀏，黃定明

（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川 成都610041）

晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是還原糖分子（如葡萄糖、果糖、戊糖等）與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸進(jìn)行非酶化學(xué)反應(yīng)形成的一組不可逆共價化合物［1］。AGEs能與細(xì)胞膜上的AGEs受體（receptor for AGEs，RAGE）結(jié)合而啟動下游信號級聯(lián)反應(yīng)，參與神經(jīng)退行性疾病、動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、衰老和某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［2］。

人口腔上皮、牙髓組織、牙周組織及唾液腺中均存在RAGE［3-4］。口腔癌、舍格倫綜合征、糖尿病相關(guān)的牙周炎等口腔疾病與AGEs的升高和RAGE的高表達(dá)密切相關(guān)，通過RAGE抑制劑阻斷AGE-RAGE及其下游信號通路可緩解上述疾病［5-7］。本文就AGEs及其胞膜受體RAGE進(jìn)行概述，總結(jié)目前AGERAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在口腔病理生理方面的研究進(jìn)展。

1 AGEs及其胞膜受體概述

1.1 AGEs的形成、結(jié)構(gòu)與分布 還原糖的醛基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸的氨基縮合成不穩(wěn)定的Schiff堿基中間體，緩慢重組形成相對穩(wěn)定的Amadori糖胺類中間產(chǎn)物，這兩種早期糖基化產(chǎn)物經(jīng)歷一系列脫水和重排等pH依賴反應(yīng)，產(chǎn)生羧基化合物（如丙酮醛）等中期糖基化產(chǎn)物，再進(jìn)一步地與蛋白質(zhì)的自由氨基共價結(jié)合形成穩(wěn)定交聯(lián)結(jié)構(gòu)的AGEs，該生成過程被稱為美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）或糖基化反應(yīng)（glyca‐tion reaction）［8］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少四十種AGEs，其中大部分含有賴氨酸或（和）精氨酸殘基，廣泛分布于人體血液、肌腱、腸道和肝臟等全身組織器官［9］。

1.2 RAGE的配體、結(jié)構(gòu)與異構(gòu)體 RAGE是免疫球蛋白超家族的一種多配體模式識別受體，除AGEs外，還可識別高遷移率族盒蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）、鈣結(jié)合蛋白S100家族等具有多個β折疊結(jié)構(gòu)特征的配體。RAGE作為一種跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)分為胞外、胞內(nèi)和跨膜結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)由3個免疫球蛋白樣區(qū)域（1個“V”型區(qū)域和2個“C”型區(qū)域）組成，“V”型結(jié)構(gòu)域?qū)τ贏GEs的結(jié)合是關(guān)鍵的，胞內(nèi)區(qū)則是由數(shù)十個氨基酸組成的胞漿尾巴，對于RAGE介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必不可少的［8］。

大部分RAGE是包含所有結(jié)構(gòu)域的完整跨膜蛋白，但體內(nèi)也存在單個或多個結(jié)構(gòu)域缺失的RAGE異構(gòu)體。例如因內(nèi)含子和外顯子選擇性剪切導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿尾巴編碼區(qū)域缺失而形成的內(nèi)源性分泌型RAGE（endogenous secretory RAGE，esRAGE），或者在翻譯表達(dá)后被金屬蛋白酶水解胞外結(jié)構(gòu)域、伽馬酶裂解跨膜結(jié)構(gòu)域后形成的裂解型RAGE（cleaved RAGE，cRAGE）［10］。esRAGE和cRAGE以可溶性RAGE（soluble RAGE，sRAGE）形式被釋放到全身循環(huán)，正常結(jié)合AGEs后因?yàn)槿狈Π麧{尾巴無法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制AGE-RAGE信號通路［11］。慢性牙周炎患者的齦溝液和血清中sRAGE均低于健康人水平［12］，因此可以將齦溝液和血清sRAGE作為慢性牙周炎的生物學(xué)標(biāo)志。

2 AGEs和RAGE與口腔疾病的相關(guān)性

口腔作為人體與外環(huán)境交通的重要門戶之一，烹飪的食物、富含多肽的飲料和香煙煙霧均能在口腔微環(huán)境中形成AGEs［6］。AGEs和RAGE與口腔炎癥性疾病高度相關(guān)，牙周炎人群牙齦上皮RAGE的表達(dá)較健康對照組增加［13］。炎癥牙髓組織中成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙髓成纖維樣細(xì)胞和牙髓炎時組織襯里的內(nèi)皮樣細(xì)胞中RAGE明顯上調(diào)［14］。根尖周肉芽腫組織中AGE-RAGE共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于S100-RAGE共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量，提示AGEs與RAGE的結(jié)合可能在炎癥誘導(dǎo)中占主導(dǎo)地位［15］。RAGE同樣表達(dá)于唇腺等唾液腺的肌上皮細(xì)胞和黏膜細(xì)胞中，AGEs聚集后結(jié)合和激活RAGE，從而導(dǎo)致唾液腺的炎癥性破壞，與唾液腺炎癥性疾病如舍格倫（Sjo‐gren）綜合征的形成有關(guān)［7］。在舌、牙齦、口腔黏膜和硬腭中發(fā)現(xiàn)RAGE與口腔癌高度相關(guān)，并且可能與癌變侵襲性有關(guān)［16-17］。

3 AGE-RAGE信號通路在口腔疾病中作用的研究進(jìn)展

口腔環(huán)境的AGEs與細(xì)胞膜表面受體RAGE結(jié)合后，形成AGE-RAGE信號通路，在不同組織細(xì)胞中通過對炎癥反應(yīng)，細(xì)胞的凋亡、增殖和自噬，以及成骨分化的調(diào)控，影響口腔疾病進(jìn)程。

3.1 炎癥反應(yīng) AGE-RAGE信號通路在口腔疾病發(fā)生中起促炎作用［18］。將牙齦上皮細(xì)胞暴露于富含AGEs的煙草煙霧中，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的Ras（p21）表達(dá)增加，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路被激活，白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β等炎性細(xì)胞因子釋放［19］。人牙周膜細(xì)胞中，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization do‐main，NOD）樣受體（NOD-like receptors，NLRs）家族中NLRP1和NLRP3形成的炎癥小體在AGEs的刺激下被啟動，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控刺激IL-1β大量生成［20］，從而加重炎癥反應(yīng)。

在體外培養(yǎng)的大鼠牙髓細(xì)胞中，AGEs通過RAGE激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38 MAPK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣結(jié)合蛋白家族S100A8和S100A9表達(dá)增加，分泌到胞膜外的S100A9與胞膜上Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）結(jié)合，激活NF-κB、p38、ERK和JNK等經(jīng)典炎癥信號通路，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)環(huán)［21-22］。而使用糖基化交聯(lián)抑制劑N-苯甲酰噻唑溴化物（N-phenacylthiazolium bromide），AGE-RAGE軸被阻斷，腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-6等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，牙周炎得到有效緩解［23］。

然而AGE-RAGE軸對炎癥的促進(jìn)作用在某些情況下并不明顯，在種植體骨整合的Wistar大鼠模型中，高AGEs無法觸發(fā)種植體周圍炎［3］；抗RAGE的免疫治療對Zucker肥胖大鼠AGEs相關(guān)的牙周炎沒有影響［24］。AGE-RAGE信號通路對口腔組織炎癥反應(yīng)起到抑制作用。將人口腔上皮細(xì)胞TR146與分化的中性粒細(xì)胞D-HL-60共同培養(yǎng)于Transwell中，在TR146中，AGEs通過RAGE促進(jìn)ERK和p38磷酸化，激活NF-κB，上調(diào)炎癥因子脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2（lipo‐calin-2，LCN2）的表達(dá)。LCN2具有高濃度促炎、低濃度抑炎的雙重調(diào)節(jié)作用，在TR146分泌的LCN2濃度較低的情況下，抑制共培養(yǎng)環(huán)境中性粒細(xì)胞IL-6的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移，發(fā)揮抑炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，因此AGE-RAGE-LCN2可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)影響牙周炎的病理狀態(tài)［25］。見圖1。

Figure 1.The role of AGE-RAGEsignal pathway in inflammation.圖1 AGE-RAGE信號通路在炎癥反應(yīng)中的作用

3.2 細(xì)胞生理活動 AGE-RAGE信號通路能夠調(diào)控凋亡、增殖、自噬等細(xì)胞活動從而影響細(xì)胞的狀態(tài)。人牙周膜成纖維細(xì)胞用AGEs處理后表達(dá)較高水平的RAGE，下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)，細(xì)胞凋亡率較對照組明顯上升［26］。同時，AGE-RAGE導(dǎo)致人牙周膜細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，線粒體形態(tài)以及動力學(xué)發(fā)生改變，引起線粒體依賴性凋亡［27］。大鼠頜下腺中也發(fā)現(xiàn)AGEs刺激RAGE表達(dá)上調(diào)，凋亡標(biāo)志因子BAD、Bax和caspase-3均強(qiáng)于對照組，腫瘤蛋白p53被早期激活［28］。此外，AGEs環(huán)境下，間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均下降，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等生長因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低［29］。而RAGE抑制劑FPS-ZM1的使用可阻斷RAGE-NF-κB信號通路，進(jìn)而恢復(fù)其增殖能力［30］。

在口腔腫瘤組織中，AGE-RAGE軸對細(xì)胞活動表現(xiàn)出與上述相反的影響。在口腔鱗癌細(xì)胞系中，AGEs通過RAGE促進(jìn)ERK磷酸化，上調(diào)Ras和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT），激活細(xì)胞內(nèi)NFκB信號通路，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（matrix metal‐loproteinase-2/9，MMP-2/9）的 表 達(dá)，細(xì) 胞 遷 移 加強(qiáng)［31-32］；同時，ERK磷酸化抑制下游核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）-血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）信號，抑制抑癌蛋白p53和Bax的表達(dá)，而Bcl-2家族中凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-xL蛋白表達(dá)增強(qiáng)，協(xié)同抑制p53信號通路，抑制細(xì)胞凋亡［33］；此外AGE-RAGE導(dǎo)致VEGF上調(diào)，增強(qiáng)腫瘤血管生成能力，為腫瘤細(xì)胞生長提供所需的營養(yǎng)環(huán)境［34］。

在人牙周膜細(xì)胞，AGE-RAGE還能通過激活ERK1/2通路下調(diào)p62表達(dá)，促使自噬分子標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的胞漿型（LC3-I）向自噬體膜型（LC3-II）轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生自噬小體，減少細(xì)胞的凋亡［27］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，AGEs通過AKT介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)自噬水平升高，減輕AGEs誘導(dǎo)的凋亡程度［35］。這可能是AGEs促進(jìn)細(xì)胞存活的另一種保護(hù)機(jī)制，為AGE-RAGE相關(guān)口腔疾病提供一種新的治療策略。見圖2。

Figure 2.The role of AGE-RAGEsignal pathway in cellular physiological activity.A：cellular protection；B：cellular injury.圖2 AGE-RAGE信號通路在細(xì)胞生理活動中的作用

3.3 成骨分化 AGE-RAGE信號通路對成骨分化存在雙重調(diào)控作用。在人牙周膜干細(xì)胞中，AGEs通過激活RAGE和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子蛋白激酶Cβ2（protein kinase Cβ2，PKCβ2）負(fù)向調(diào)控成骨分化標(biāo)志物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）的表達(dá)；胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）通過抑制PKCβ2磷酸化可逆轉(zhuǎn)AGEs對成骨分化的負(fù)面影響［36］。AGEs與RAGE的結(jié)合還能增加DNA甲基化程度，上調(diào)糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β），使β-連環(huán)蛋白（β-catenin）和淋巴樣增強(qiáng)子結(jié)合因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1）出現(xiàn)時間依賴性下調(diào)，Wnt信號通路受到抑制，從而抑制細(xì)胞成骨向分化［37］。

但也有研究表明，AGEs作用于牙髓細(xì)胞后，RAGE、OPN和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的mRNA和蛋白水平表達(dá)都增加，對ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)形成有明顯的促進(jìn)作用，而對牙齦成纖維細(xì)胞無明顯影響［38］。

4 糖尿病通過AGE-RAGE信號通路影響口腔病理生理狀態(tài)

糖尿病作為口腔疾病最相關(guān)的全身系統(tǒng)性疾病之一，主要特點(diǎn)是AGEs的高表達(dá)。患糖尿病的牙周炎人群較單純牙周炎人群，RAGE的表達(dá)更高，齦溝液中炎癥因子如TNF-α和IL-1β均增加，牙周炎癥更重［39-40］。在大鼠模型中，糖尿病顯著增加牙齦和牙周膜炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時間［41］；同時，AGE-RAGE刺激血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子1（intercel‐lular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)增強(qiáng)，血管通透性增加，從而加重炎癥反應(yīng)［42］。

成骨細(xì)胞的RAGE在高糖環(huán)境中表達(dá)水平較高，此時牙槽骨對AGE-RAGE的調(diào)控更加敏感［43］。糖尿病病人和大鼠血清中AGEs的存在能夠顯著降低成骨細(xì)胞在鈦種植體表面的黏附，從而延遲種植體的骨整合［44］。此外，高糖環(huán)境可通過促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的凋亡而對牙周組織造成負(fù)面影響，形成糖尿病第六大并發(fā)癥——牙周病［45-46］。

AGE-RAGE在唾液腺中能夠激活NF-κB通路，產(chǎn)生唾液腺炎，同時上調(diào)Bax和caspase-3導(dǎo)致腺體細(xì)胞凋亡，從而引起唾液腺分泌功能障礙［47］。在牙髓細(xì)胞中，AGE-RAGE上調(diào)OPN和OCN，增加成骨向分化，這在一定程度上解釋了糖尿病患者牙髓組織常出現(xiàn)病理性鈣化的原因［38］。

5 小結(jié)

AGEs通過RAGE及其下游NF-κB、MAPK、AKT等信號通路在口腔組織疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。目前病理生理學(xué)研究主要集中于炎癥反應(yīng)、以凋亡為主的細(xì)胞生理活動以及成骨分化三大方面，對細(xì)胞自噬僅進(jìn)行了初步探究。上述各方面的生物學(xué)效應(yīng)仍存在爭議，應(yīng)在口腔疾病模型中進(jìn)一步研究。

此外，全身系統(tǒng)性疾病糖尿病通過AGE-RAGE與牙周病、唾液腺疾病、牙髓鈣化等口腔疾病建立聯(lián)系，提示了全身與口腔的關(guān)鍵性結(jié)點(diǎn)，在AGE-RAGE信號通路中有望找到相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)。