miR-17-92簇對慢性粒細胞白血病細胞K562增殖和凋亡的影響

鄭研，李嵐，高秋英，牛奔，張維華

陜西省人民醫院血液內科，西安 710068

miR-17-92基因簇位于人13q31.3染色體，具有高度保守性，編碼miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92六個成熟的miRNA[1]，被認為是原癌基因miRNA的代表，在多種腫瘤的發生發展中發揮重要作用[2]。miR-17-92基因簇與細胞增殖和凋亡密切相關，有望成為潛在的腫瘤標志物或治療新靶點[3]。腫瘤細胞中miRNA可通過Notch、Wnt/β-catenin、轉化生長因子-β(TGF-β)等多種信號通路調控細胞的生長增殖[4]。TGF-β是一組負責調控細胞生長、分化和增殖的多效性細胞因子[5]，其中TGF-β1是TGF-β家族中一種多功能生長調控因子。研究發現，TGF-β1參與多種腫瘤細胞的調控作用，與細胞的分化、生長與發育等密切相關[6-7]。miR-17-92在慢性粒細胞白血病(CML)細胞中扮演何種角色以及與TGF-β1信號通路的關系仍不明確。本研究旨在探討miR-17-92在CML細胞增殖和凋亡中的調控角色以及與TGF-β1信號通路的關系，這對了解CML發生機制及臨床攻克CML具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料 16例CML骨髓標本和13例健康者骨髓標本來自陜西省人民醫院。CD34+細胞磁柱分選試劑盒(Easy Sep human CD34 Selection Kit，德國美天旎生物技術有限公司，批號：130-046-702)分選CML骨髓標本和健康者骨髓標本中的CD34+細胞，將分離的細胞按1×106/mL的密度接種至24孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養。CML細胞系K562由中國科學院上海細胞所提供，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度的培養箱中培養，待細胞密度達到80%時進行傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 RT-qPCR檢測miR-17-92簇表達 采用Trizol 試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)根據其說明書提取K562細胞和健康者造血干細胞的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測RNA質量。使用TaqMan? Micro RNA Reverse Transcription Kit反轉錄試劑盒(美國，AB Applied Biosysytems)分別反轉錄u6、17、18a、19a、20a、19b、92 cDNA。利用 u6、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92探針引物進行real-time PCR檢測，在7500 Fast Real-Time PCR儀(Agilent Technologies)上進行操作，20 μL反應體系：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，miRNA正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，反轉錄產物(1∶3稀釋)2 μL，無酶水 6 μL；反應條件：95 ℃ 34 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環，反應結束后記錄各反應管Ct值，以U6為內參，采用2-ΔΔCT法定量分析miR-17-92基因簇的相對表達量。miR-17-92基因簇引物序列如表1所示。

表1 hsa-miR-17-92引物序列

1.3 細胞轉染 K562細胞按2×105/孔鋪于24孔板上。miRNA mimic(control、miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92)購于上海生工生物科技公司，無血清RPMI 1640培養基25 μL與上述質粒混合，室溫靜置5 min。將稀釋的轉染試劑和 miRNA mimic混合，室溫靜置10 min?；旌衔锛尤胫罧562細胞中，進行瞬時轉染。

1.4 細胞增殖能力檢測 miRNA mimic轉染K562細胞后，分別于培養0 h、24 h、48 h、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，7 ℃孵育3 h后使用全波長酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD450)，以450 nm處的吸光度表示細胞的增殖能力。

1.5 細胞凋亡檢測 miRNA mimic轉染K562細胞48 h后，收集各轉染組細胞，800 r/min離心5 min，棄上清，用100 μL binding buffer重懸細胞。取2×105個細胞鋪于24孔板，培養48 h后，分別加入Annexin V-APC和Propidium Iodide(PI)5 μL，室溫下避光15 min后，染色，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6 Western-blot檢測TGF-β1蛋白的表達 miRNA mimic轉染K562細胞48 h后，收集各轉染組細胞，利用4 ℃預冷的蛋白裂解液置于冰上裂解細胞；采用HeraeusMultifuge×1R離心機(美國，ThermoScientific，離心機半徑40 cm)，4 ℃、1 200 r/min離心20 min，取上清液，即為提取的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。利用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，后轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST稀釋抗體，1∶1 000加一抗，4 ℃過夜，TBST洗3遍，TBST稀釋抗體，1∶5 000加二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3遍。ECL發光劑加于膜上，發光儀曝光，采集圖像，以GAPDH蛋白作為內參，分析檢測TGF-β1蛋白的表達。

2 結果

2.1 CML及健康者CD34+細胞中miR-17-92簇表達水平 結果顯示，CML的CD34+細胞中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-92表達水平均高于健康者CD34+細胞，差異有統計學意義(P值均< 0.05)，兩組CD34+細胞中miR-20a和miR-92表達差異有統計學意義(P< 0.001)，而兩組miR-19b表達水平差異無統計學意義(P> 0.05)。見圖1。

注：與健康者CD34+細胞比較，aP< 0.05,bP< 0.01,cP< 0.001圖1 健康者CD34+細胞及CMLCD34+細胞中miR-17-92表達水平

2.2 miR-17-92抑制K562細胞凋亡 細胞凋亡實驗結果顯示，轉染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92后K562細胞凋亡率較健康對照組均顯著降低(P< 0.05)。見圖2。

2.3 miR-17-92促進K562細胞增殖 細胞增殖實驗結果顯示，轉染48 h、72 h后，轉染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92 的K562細胞增殖能力較健康對照組均顯著升高，差異有統計學意義(P< 0.05)。見圖3。

2.4 Western-blot檢測 利用Western-blot檢測轉染miR-17-92后K562細胞中TGF-β1蛋白表達水平，結果顯示：轉染miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b、miR-92后K562細胞中TGF-β1蛋白相對表達量較健康對照組顯著升高，差異有統計學意義(P值均< 0.01)。見圖4。

注：與模擬對照比較，aP< 0.05，bP< 0.01圖2 轉染miR-17-92 mimic對K562細胞凋亡的影響(n=3)

注：與模擬對照比較，aP< 0.05圖3 轉染miR-17-92 mimic對K562細胞增殖能力的影響(n=3)

注：與模擬對照比較，aP< 0.01圖4 轉染miR-17-92 mimic對K562細胞中TGF-β1蛋白表達水平的影響(n=3)

3 討論

CML是臨床常見的造血干細胞增生性疾病，其發病率和死亡率在我國乃至世界仍居高不下。miRNA通過參與原癌基因及抑癌基因等多種基因表達調控，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡及分化等生理進程[8]。miRNA既可作為癌基因或抑癌基因，也可調控腫瘤信號通路上關鍵基因的表達，發揮腫瘤調控作用[9]。miRNA的異常表達是造血系統腫瘤的特征之一。目前，miR-17-92基因簇在結腸癌、胰腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌及造血系統腫瘤等多數研究中均被報道異常高表達，發揮促癌基因的作用[10-14]。有研究發現，miR-17-92簇/QKI2/catenin組成的調控軸促進了骨肉瘤的發生發展[15]。

本研究對CML CD34+細胞中miR-17-92基因簇編碼的6個成熟miRNA表達水平進行測定，發現6個miRNA均呈現高表達，提示miR-17-92可能在CML發病過程中發揮重要調控作用，miR-17-92中每個miRNA單獨或者協同發揮致癌基因的作用，本研究結果與多數學者認為miR-17-92基因簇發揮促癌基因的作用結果一致。本研究將miR-17-92 mimic轉染于K562細胞中，旨在明確miR-17-92在CML細胞增殖和凋亡中的調控角色。有研究報道，miR-17-92作為癌基因，其異常表達可導致細胞增殖和凋亡失控，加速腫瘤的發生發展[16]。食管鱗癌中，miR-18a通過調控PTEN-PI3K-AKT-mTOR信號軸，促進細胞增殖[17]。本研究對各轉染組細胞增殖能力測定發現轉染miR-17、18a、19a、20a、19b、92促進了K562細胞的增殖，且每種單一micro RNA的促增殖作用強度并不完全一致，提示miR-17-92簇在CML中發揮主要作用的并不是micro RNA簇內所有基因，而是某些miRNA起主導作用。對各轉染組細胞凋亡情況檢測發現，miR-17-92的表達抑制了細胞凋亡。結果與既往報道在肺癌細胞中的研究結果相一致[18]。其中每種miRNA抑制凋亡的強弱作用不完全相同，如轉染miR-18a抑制凋亡效果更為明顯，提示miR-17-92在CML中發揮作用并不是miR-17-92簇中所有miRNA。

明確miR-17-92表達調控機制，對尋找新的CML治療靶點，改善患者預后具有重要臨床意義。TGF-β1以無活性的形式合成并分泌，在磷酸化激酶作用下活化后與不同的受體結合，進一步啟動TGF-β1信號轉導通路，表現出多樣的生物學活性，調控細胞增殖、凋亡、周期、上皮間質轉化(EMT)等多個生理過程[6-7]。許多細胞表面都有TGF-β受體(TGFBR)，TGF-β1的腫瘤生長調節作用與結合的受體直接相關，結合的受體不同，發揮的作用也不同。Matsuzaki等[19]認為，腫瘤進展期中，細胞微環境的改變導致TGF-β1從一個抑制信號演變成激發信號，通過促進EMT作用誘導細胞遷移、侵襲和轉移。Zeng等[20]發現，miR-23a簇通過調節TGF-β信號通路促進成骨細胞分化。本研究對轉染miR-17-92后TGF-β1蛋白的表達水平進行測定，發現miR-17-92能使TGF-β1蛋白的表達水平升高，提示miR-17-92可能通過激活TGF-β1信號通路促進細胞增殖、抑制凋亡。目前研究認為，TGF-β1信號通路在參與腫瘤發生機制中，除了TGF-β1蛋白表達水平的改變以外，TGFBR蛋白及其下游信號分子Smads等均是TGF-β1信號通路中的關鍵點。因此，對于miR-17-92如何調控TGF-β1信號通路還需要進行更加深入的研究。

綜上所述，miR-17-92在慢性粒細胞白血病細胞K562中異常高表達，miR-17-92表達促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，此過程中TGF-β1信號通路的激活可能發揮關鍵作用。