他克莫司及其血藥濃度檢測方法研究進展

曹愛霖，王學彬，王 卓*，徐 寧

(1.浙江工業大學藥學院新藥開發研究所，杭州 310014；2.海軍軍醫大學長海醫院藥學部，上海 200433)

治療藥物監測(therapeutic drug monitoring,TDM)是通過測定血藥濃度并觀察藥物臨床治療效果，根據藥動學原理調整給藥方案，從而達到理想治療效果的一種方法。目前臨床主要針對具有治療指數窄、個體間血藥濃度差異大、非線性藥動學特征等特點的藥物開展TDM。

他克莫司(tacrolimus，又稱FK506)是從鏈霉素屬分離提取的強效免疫抑制性二十三元環大環內酯類抗生素，口服吸收后，血漿中游離的他克莫司會被轉運至T細胞，最終形成他克莫司-他克莫司結合蛋白-Ca2+-鈣調蛋白-鈣調磷酸酶的五聚物發揮藥理作用[1]，產生強大的免疫抑制作用，臨床主要用于預防腎臟、肝臟等器官移植術后的排異反應。目前，國際最新指南均強烈推薦腎臟移植患者術后長期使用包含鈣調磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor，CNI)的免疫抑制方案，其中首推他克莫司[2-3]。他克莫司在體內分布廣泛、清除率低，口服后需要數天時間達到穩態血藥濃度，并且治療窗窄，低濃度下易出現排異反應，高濃度時腎毒性和神經毒性增加[4]，即使血藥濃度在治療窗內，患者也常發生腎毒性、消化系統不適等藥品不良反應。他克莫司在不同器官移植患者的藥動學及藥效學有明顯個體差異，給臨床治療時的藥物劑量調整帶來難度，因此選擇合適的方法對他克莫司開展TDM，獲得精準的血藥濃度，顯得尤為重要。

1 他克莫司的體內分布

他克莫司口服后經胃腸道吸收，生物利用度為20%～25%，吸收后呈雙相分布，因其可與紅細胞廣泛結合，紅細胞中的他克莫司濃度平均可達血漿濃度的約15倍，比值受紅細胞比容、血漿蛋白和他克莫司濃度影響。血漿中98.8%的他克莫司與血漿蛋白結合，主要結合血清白蛋白和α-1-酸性糖蛋白；紅細胞內的他克莫司并不與血紅蛋白結合，而是與他克莫司結合蛋白(FK506-binding proteins，FKBP)結合(主要是FKBP-12)，且紅細胞對他克莫司的攝入會因他克莫司濃度的升高而出現飽和。他克莫司在血漿中與血漿蛋白的結合同樣存在飽和現象[4]。

他克莫司的高血漿蛋白結合率使得其半衰期長而清除率低，但不同的人群會出現藥物體內分布的差異，如妊娠期婦女會因血漿蛋白和紅細胞計數降低而出現游離的他克莫司比例升高及他克莫司清除率升高的情況[5]。

2 他克莫司的體內代謝

他克莫司的代謝主要依賴肝臟及腸壁內的CYP3A4和CYP3A5，代謝產生至少15種甲基化、羥基化或去甲基化的代謝產物，以13-O-去甲基他克莫司(M-Ⅰ)和15-O-去甲基他克莫司(M-Ⅲ)為主，其中M-Ⅰ的藥理活性為他克莫司的10%，而31-O-去甲基他克莫司(M-Ⅱ)雖然活性與他克莫司相似，但體內含量幾乎難以檢測[5]。

3 他克莫司血樣的穩定性

目前，臨床檢測他克莫司濃度的樣本主要是全血，血樣的穩定性決定了后續檢測結果的精確度和準確性。他克莫司全血樣本在22 ℃或4 ℃可以保存14 d，在-20 ℃可以保存1個月，在-70 ℃可保存1年[6-7]；代謝產物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅲ在室溫下可以保存3 d，-20 ℃可以保存1個月，-80 ℃可保存1年[6,8]。反復凍融3次并不會大幅度影響定量檢測結果，但-80 ℃保存6個月以上會使樣本中的游離他克莫司濃度增加30%[5]。因此，臨床檢驗窗口在收到患者的血樣后應及時處理和檢測，如需長期保存，應在冷藏30 min后再進行冷凍保存。

4 他克莫司目前常用檢測方法

因為他克莫司在血漿中和紅細胞中與血漿蛋白的結合是非線性的，單純測紅細胞中或者血漿中的他克莫司濃度并不能反映他克莫司的真實濃度，他克莫司的全血濃度更能反映臨床事件，因此必須要檢測其全血濃度[9]，且檢測過程中需要對血樣進行破紅細胞處理。

他克莫司在全血中的治療濃度區間為5～20 μg/L，在全血的檢測限為0.5～1 μg/L[10]。研究者在近30年開發出多種他克莫司的血藥濃度檢測方法(見表1)，主要分為三大類：一是色譜法，主要是LC-MS/MS法；二是免疫法，包括化學發光微粒子免疫檢測法、酶放大免疫檢測法等；三是基于微采樣等新技術的檢測法，主要是體積吸收微采樣聯合液質法等。

表1 不同他克莫司血藥濃度檢測方法比較Table 1 Comparison of different detection methods of tacrolimus in blood

4.1 LC-MS/MS法 LC-MS/MS法是檢測免疫抑制藥物血藥濃度的金標準[10]，此方法有更高的靈敏度和特異性、更低的檢測限和定量限，通過檢測質荷比(m/z)進行定量。與免疫法相比，LC-MS/MS法更易區分待測物與結構相似的代謝物。DUBBELBOER等[6]成功建立并驗證了他克莫司及其代謝物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅲ的LC-MS/MS定量分析方法，待測血樣需要經過蛋白沉淀劑和固相萃取(solid-phase-extraction，SPE)處理，因為此方法避免了代謝產物對他克莫司檢測的干擾，故檢測出來的血藥濃度略低于免疫化學法的檢測結果。Lee等[11]報道了一種UPLC-MS法，可以同時快速測量全血中的環孢素和他克莫司，適合治療濃度區間較大的免疫抑制劑。SALLUSTIO等[12]研究表明，在定量檢測全血中他克莫司濃度時，與免疫法和常規HPLC法相比，LC-MS/MS法在重復性和精確性方面有顯著優勢。

然而，LC-MS/MS法的缺點也很明顯，主要包括檢測耗時長、儀器昂貴、血樣需要經過預處理、血樣需要集中到有資質的實驗室(如中心實驗室)進行測定。

4.2 化學發光微粒子免疫檢測法 化學發光微粒子免疫檢測(chemiluminesent microparticle immunoassay，CMIA)法是近十年發展起來的一種免疫分析技術，利用免疫反應的特異性和化學發光的高敏感性，以測量吖啶酯標記物在堿性介質中發生化學反應所產生的光子量為基礎，以類磁顆粒作為包被載體[13]。類磁顆粒的作用主要是增加反應的表面積，提高反應靈敏度，縮短反應時間，反應過程中采用磁力吸附分離，沖洗徹底，因而具有更高的特異性。CMIA法在國內外應用廣泛，可實現多樣本、多品種同時檢測，目前主要利用雅培公司生產的Architect系列機型實現血樣檢測，全血樣品中他克莫司的濃度在1～15 ng/ml范圍內，CMIA法和金標準LC-MS/MS法的檢測結果相關性較好[14]。金瑛等[15]收集了581份全血樣本，分別用LC-MS/MS法和CMIA法進行他克莫司濃度檢測，結果顯示CMIA法檢測結果與LC-MS/MS法檢測結果的相關系數為0.902 4，相關性良好，結果重復性好，但大量樣本的CMIA法檢測結果平均值略高于LC-MS/MS法檢測結果[(9.21±3.65) ng/mlvs(6.30±2.69) ng/ml]。

4.3 酶放大免疫檢測法 酶放大免疫檢測(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)法，又稱為酶增強免疫檢測技術，于1972年由RUBENSTEIN首先提出，1974年應用于苯妥英鈉TDM項目，1990年開始應用于免疫抑制劑的檢測[16]。EMIT法的原理是受檢品中的藥物和試劑中用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)標記的藥物競爭定量的抗體結合位點，酶標記的藥物與抗體結合后將喪失活性，存留下來的具有活性的酶將抗體試劑中的煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD)轉化為還原態(NADH)，從而導致吸光度的改變。酶濃度的變化反映了待測樣品中藥物的濃度[17]。

隨著EMIT法的廣泛應用，其缺點也逐步顯現出來。研究顯示，在應用EMIT法檢測時，檢測結果會因樣本中存在某些與待測藥物有相似結構的抗原而出現交叉反應，從而使檢測結果出現偏差[18]。SAINT-MARCOUX等[19]分別采用EMIT、CMIA和LC-MS/MS法檢測45例腎移植術后患者的他克莫司血藥濃度和藥動學參數，結果顯示，EMIT法和CMIA法檢測的平均濃度分別比LC-MS/MS法檢測的平均濃度高15%和11%，且在3.0～5.0 ng/ml濃度范圍內的樣本檢測結果并不可靠[5]。但是，EMIT法相對于微粒酶免疫分析法前處理時間更短，且可實現單樣本檢測，而檢測結果相似[20]。

4.4 微粒酶免疫分析法 微粒酶免疫分析(microparticles enzyme immunoassay,MEIA)法所用儀器為雅培公司的全自動免疫分析儀(IMx)，操作方便，檢測時間短，結果可迅速反饋臨床，但專一性不強，易與代謝產物發生免疫反應，從而使監測結果發生偏差[13]，且不同批次試劑盒差異較大，更換試劑盒需重新制作質控數據分布圖，以便校正測定結果[21]。李鵬飛等[22]利用IMx儀器和液相色譜-串聯質譜儀對他克莫司全血樣品進行了798例次的濃度測定，結果顯示，MEIA法測定心、肺、肝、腎移植患者的他克莫司濃度分別比LC-MS/MS法檢測結果高9.9%、13.2%、13.1%和18.2%，并且由于他克莫司個體藥動學差異大，這種偏差很難控制在一定范圍內。目前MEIA的試劑盒已經停產，雅培公司生產的Architect系列機型已全面取代IMx用于臨床檢測。

4.5 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法是實驗室檢測他克莫司的早期用法，具有靈敏度高、特異性強的特點，能夠有效保證檢測結果的準確性。同時，ELISA法操作簡便，所需設備少，能夠快速檢測全血中他克莫司的濃度。平行對照研究[23]顯示，ELISA法檢測的他克莫司血藥濃度與LC-MS/MS法檢測結果存在一定的相關性，ELISA法的測定結果要普遍高于LC-MS/MS法的測定結果(AUC0～24 h高20.1%)。在較高質量濃度組(≥10 ng/ml)，兩種檢測方法結果的偏差與ELISA法的試劑與他克莫司在體內的代謝產物發生交叉反應，干擾檢測結果有關。此外，ELISA法檢測他克莫司還受患者肝功能的影響[24]，與肝功能正常的患者相比，肝功能損傷患者的檢測結果偏高。分析原因是損傷的肝功能影響了他克莫司在肝臟的代謝，蓄積的他克莫司代謝產物對ELISA法檢測結果產生干擾，使結果偏高。

4.6 電化學發光免疫分析法 電化學發光免疫分 析(electrochemiluminescent immunoassay,ECLIA)法由羅氏診斷產品有限公司研發，借助于電化學發光全自動免疫分析儀(cobase 411等)實現了他克莫司全血濃度檢測。其檢測原理為標記在抗體上的化學發光劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+與電子供體三丙胺在陽電極表面發生氧化還原反應,生成三價的吡啶釕[Ru(bpy)3]3+，后被還原形成激發態的二價吡啶釕[Ru(bpy)3]2+*，激發態的二價吡啶釕衰減成基態吡啶釕[Ru(bpy)3]2+時,會發射一個波長為620 nm的光子，周而復始，被信號接收器捕獲[25]。該方法于2014年被引入國內，小范圍應用于臨床環孢素和他克莫司的TDM，具有檢測范圍廣、精密度高、結果與LC-MS/MS法檢測結果相關性好、檢測速度快等優勢，但是也有檢測成本高等缺點。SHIPKOVA等[26]針對ECLIA法測定他克莫司全血濃度與LC-MS/MS法作了頭對頭研究，結果顯示ECLIA法的測定結果與LC-MS/MS法存在11%的偏差，可能是標記抗體與活性代謝物M-Ⅱ相互作用所致。2018-01-03羅氏診斷產品有限公司在國家食品藥品監督管理總局(CFDA)官網上發布了對電化學發光全自動免疫分析儀(cobas 8000)的主動召回公告，原因是儀器在極少數情況下會出現核心模塊自動將控制單元軟件的系統設置重置為默認值，導致數據不匹配。

4.7 體積吸收微采樣聯合液質法 體積吸收微采樣(volumetric absorptive microsampling,VAMS)技術[27]是Neoteryx公司研發的，可以克服血細胞比容對檢測結果影響的微創采樣技術?；颊咴诩抑欣梦⑿腿悠鞑杉讣庋瑑Υ嬖赩AMS裝置中，送到實驗室，應用50%甲醇溶液、0.2和0.5 mol/L的硫酸鋅甲醇溶液進行萃取，然后經渦旋、聲波降解等步驟處理，最后使用LC-MS/MS法進行定量檢測。VAMS技術可以讓患者在家中就實現血液采集，方便、微創、經濟，且儲存在VAMS裝置中的他克莫司全血樣品在43 h內穩定可靠[27]。目前，VAMS技術聯合LC-MS/MS法檢測他克莫司血藥濃度尚不成熟，檢測結果的可信度有待進一步研究。

4.8 生物傳感器技術 生物傳感器技術(biosensors techniques)自首次報道至今已有近60年的歷史，目前廣泛應用于醫藥、工業生產、環境衛生等領域，主要依靠換能器表面的生物分子受體與待測分析物的相互作用來實現檢測[28]。依據設計不同，傳感器可以分為光學傳感器技術(如表面等離子共振光譜、表面增強拉曼光譜等)、機械傳感器技術(如石英晶體微天平等)和電化學傳感器技術。在TDM領域，生物傳感器技術主要用于抗腫瘤藥甲氨蝶呤和氨基糖苷類抗菌藥物的檢測，但鮮有關于免疫抑制劑的報道[29]。生物傳感技術雖然具有敏感度高、選擇性高的優勢，但也存在標準化程度不夠、可控性差等劣勢[28]，這些劣勢限制了其在免疫抑制劑血藥濃度檢測中的應用由實驗室走向臨床的腳步，但隨著納米生物傳感技術的開發應用日趨成熟，在不久的將來，有望實現他克莫司的快速、精確檢測。

4.9 膠乳增強免疫比濁法 上海云澤生物科技有限公司于2018年申請了基于高靈敏度膠乳增強免疫比濁法(latex-enhanced immunoturbidimetry)測定全血樣品中他克莫司濃度的發明專利[30]，主要檢測原理是將他克莫司抗體交聯在聚苯乙烯乳膠微球表面，與他克莫司蛋白復合物反應，帶動聚苯乙烯微球聚集，產生一定濁度，而全血中的他克莫司競爭性結合聚苯乙烯微球表面的單克隆抗體，此時的濁度與全血中的他克莫司濃度成反比，從而利用全自動生化儀在400～800 nm波長下檢測他克莫司濃度。該方法于2020年1月授權公開，目前尚無文獻報道。

5 小 結

他克莫司自20世紀90年代初研發問世至今已有30年，目前有完全取代環孢素臨床地位的趨勢，但他克莫司和環孢素一樣，在臨床應用時也需要定期監測血藥濃度，依據血藥濃度監測結果并結合臨床表現來調整用藥劑量。他克莫司的血藥濃度檢測方法經歷了更新換代，檢測方法的進步為個體化醫療服務提供了技術保障，對促進臨床合理用藥有重要意義。雖然LC-MS/MS法仍然是檢測他克莫司血藥濃度的金標準，但在精準檢測血藥濃度的同時，如果可以兼顧快速、便捷，將有助于提高患者的依從性，為臨床安全用藥提供幫助。新一代的檢測技術如微流控芯片技術、拉曼光譜技術[33]等已經在實驗室取得了初步成果，如果能成功走向臨床，必將為患者提供更好的就診體驗。