山藥-黃芪藥對治療2 型糖尿病性骨質疏松的網絡藥理學機制研究

趙元 李香斌 張尚斌 陳劍平*

1. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518033

2. 深圳市中醫院/深圳市醫院中藥制劑研究重點實驗室，廣東 深圳 518033

3. 北京中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518172

2 型糖尿病性骨質疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)是糖尿病常見的并發癥之一，是一種全身性代謝性骨病。T2DOP的發病率隨糖尿病患者群體的不斷擴大而逐年升高，而中國糖尿病患者骨質疏松的發病率為40%～66%[1]。T2DOP患者因骨脆性和微血管并發癥導致的微裂紋而極易引起骨折[2]，不僅嚴重影響患者生活質量，而且給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。現代醫學的治療原則主要為控制原發病和補充鈣劑及維生素D[3]，但效果不顯著。中醫藥作用的多靶點性在臨床治療多因素影響的復雜的T2DOP有一定的優勢。在傳統中醫學中，T2DOP屬于“消渴”合并“骨痿”范疇，腎虛和脾虛是其重要病機[1]。山藥和黃芪始載于《神農本草經》并列為上品，山藥，補脾養陰，生津益肺，強腎固精；黃芪，補氣升陽，益水之源，生津養血。二藥相配補脾固腎，益氣生津，二者一陰一陽，相互促進，一則使脾氣升，散精達肺，輸布津液以止渴，二則使腎氣固，封藏精微以生髓，且山藥長肌肉堅強筋骨，治療“消渴”并“骨痿”有標本兼治的效果。二者均是糖尿病合并骨質疏松的常用藥物[4～6]，且現代藥理研究[7]顯示山藥能通過調控Wnt和p38信號通路而具有抑制骨丟失作用，作為PPARγ的激動劑、AMPK激活劑而治療2 型糖尿病[8]。黃芪甲苷通過調節PI3K/Akt/FoxO1通路抑制糖尿病大鼠肝糖異生[9-10]，黃芪多糖可直接促進成骨細胞質增殖、提高成骨細胞活性[11]，但二者配伍治療T2DOP的作用機制卻未見研究。本研究通過網絡藥理學研究的方法探討黃芪和山藥配伍治療T2DOP的作用機制，為日后兩者配伍治療T2DOP研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1“山藥-黃芪”藥對化學成分：在中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索山藥、黃芪對應的化學成分，篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%且類藥性(drug likeness, DL)>0.18。

1.1.2T2DOP疾病相關基因：以“Type 2 diabetic osteoporosis”為關鍵詞，在Gene cards和 OMIM數據庫中檢索T2DOP相關基因，去除重復靶點，匯總得到與T2DOP相關的疾病靶點。

1.1.3“山藥-黃芪”藥對的活性成分靶標：在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)數據庫中查詢1.1.1中所得化學成分的預測靶標。并在Uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org)中將預測靶標轉換為基因名，獲得靶點的Uniprot ID。

1.2 方法

1.2.1構建“山藥黃芪化學成分-山藥黃芪候選靶標-T2DOP相關靶標”網絡：利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“化學成分-預測靶標-T2DOP相關靶標”網絡，利用 Cytoscape軟件中Network Analyzer插件進行網絡分析，并獲取網絡拓撲參數，篩選大于度中心性、接近中心性、中介中心性/中間中心性三者均值的節點。

1.2.2基因功能估計分析：將篩選節點中的靶標通過David 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行GO生物學富集分析，包括生物過程(biological process, BP)，分子功能(molecular function, MF)和細 胞 組 成(cellular component, CC)3 個部分，設定閾值P<0. 05，結果以氣泡圖形式進行可視化展示。

1.2.3KEGG富集分析及可視化：運用R語言軟件對關鍵靶點進行信號通路富集分析，挑選與T2DOP相關的信號通路，最終設定閾值P<0. 05。

1.2.4“山藥黃芪化學成分-關鍵作用靶點-信號通路”網絡的構建：利用Cytoscape 3.7.1軟件將1.2.1中得到的網絡節點及1.2.3中富集的信號通路構成“山藥黃芪化學成分-關鍵作用靶點-信號通路”網絡，通過計算該網絡的拓撲特征值，判斷山藥黃芪治療T2DOP的關鍵化學成分、作用靶標及信號通路。

2 結果

2.1 “山藥-黃芪”藥對中活性組分的篩選

在TCMSP中查詢到符合篩選條件的山藥活性成分16 個、黃芪20 個，最終共篩選出36個化合物，見表1。

表1 “山藥-黃芪”藥對的候選活性成分信息

2.2 T2DOP疾病靶基因的篩選結果

在Gene cards網站收集得到T2DOP疾病靶標共3 180 個，OMIM網站收集得到183 個T2DOP靶標，合并2 個數據庫數據，剔除重合基因，共檢索出3 305 個相關基因信息。

2.3 “山藥-黃芪”藥對中活性成分的靶標預測

將篩選出的36 個成分分別在TCMSP平臺和Swiss Target Prediction網站中查詢預測的靶點，并通過Uniprot數據庫將蛋白靶點轉化為靶點基因，其中山藥16 個成分，370 個靶基因；黃芪20 個成分，547 個靶基因，最終共有36 個化合物，去除重復靶基因后共698條靶基因信息。

2.4 “山藥黃芪化學成分-山藥黃芪候選靶基因-T2DOP相關靶基因”網絡的構建

利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“山藥黃芪化學成分-山藥黃芪候選靶基因-T2DOP相關靶基因”網絡，見圖1。網絡中各個節點之間相互作用，根據網絡拓撲學結構分析結果，共512個節點，以大于該網絡的度中心性均值7.286 0、接近中心性0.316 8、中介中心性/中間中心性均值0.004 1為篩選條件篩選出關鍵節點67 個，其中含有靶標40 個，MET，CYP19A1，AR，PTGS1，ADORA2A，PTGS2，CDK2，GSK3B，NCOA2，ESR2，KDR，ESR1，PTPN1，SRC，RXRA，EGFR，CASP3，GABRA1，CCNA2，PARP1，CA2，ALOX12，PGR，ADRB2，NOS2，PPARG，SYK，ABL1，MAPK14，CCNB1，BACE1共31 個靶標為T2DOP疾病靶基因，此外尚有ACHE、ADORA1、ADRA1B、CA14、CA9、CDK1、CHRM1、HSD17B2、MAOB 9 個關鍵靶標。

2.5 GO 功能分析結果

使用David 6.8數據庫對山藥黃芪治療T2DOP的40 個關鍵靶點進行GO富集分析，篩選P<0.05的條目，共有87 個GO生物學條目，其中有56 個BP條目，21 個MF條目，10 個CC條目，生物過程包括肽基絲氨酸磷酸化、調節細胞增殖、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、視黃酸的反應、轉錄、ERK1和ERK2級聯的正調控、子宮內胚胎發育、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、凋亡過程的負調控等；分子功能涉及ATP結合、鋅離子結合、類固醇激素受體活性、序列特異性DNA結合、碳酸鹽脫水酶活性等。富集于細胞核、細胞膜、細胞溶質、細胞質核周區域、高爾基體、質膜胞質側的外源成分、受體復合體、核染色質、細胞連接、RNA聚合酶II轉錄因子復合物等區域。見圖2～圖4。

圖2 “山藥-黃芪”抗T2DOP潛在靶點生物過程的GO分析前10 位

圖3 山藥-黃芪抗T2DOP潛在靶點分子功能的GO分析

圖4 山藥-黃芪抗T2DOP潛在靶點細胞組分的GO分析

2.6 KEGG信號通路富集分析與化合物-靶點-通路互相作用網絡構建

利用R語言對40 個關鍵靶標基因進行KEGG 通路分析。在通路富集分析中，得到102條信號通路，其中與T2DOP相關的17 條通路，分別為VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、甲狀腺素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、內分泌抵抗(endocrine resistance)、催乳素信號通路(prolactin signaling pathway)、細胞衰老(cellular senescence)、卵巢類固醇生成(ovarian steroidogenesis)、血小板活化(platelet activation)、黏著斑(focal adhesion)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、脂肪細胞中脂解的調節(regulation of lipolysis in adipocytes)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、花生四烯酸代謝(arachidonic acid metabolism)。見圖5。

將篩選出的68 個節點及17 條T2DOP相關的KEGG通路導入Cytoseape軟件構建“化合物-靶基因-信號通路”互相作用網絡。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“山藥-黃芪”藥對中化學成分所對應的靶點與通路，見圖5。網絡中各個節點之間相互作用，根據網絡拓撲學結構分析結果，共84 個節點，該網絡的度中心性均值26.928 6、接近中心性0.442 4、中介中心性/中間中心性均值0.015 8的2倍為篩選條件篩選出關鍵節點28 個，其中含有靶標15 個，均為T2DOP疾病靶基因，按度值排序為CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2；13 個節點為化合物，按度值排序依次為山奈酚、異鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基異戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海風藤烯酮、芒柄花黃素、熊竹素、毛蕊異黃酮、異黃烷酮、蓽茇明寧堿、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol。文獻研究表明，山奈酚[12-13 ]對2 型糖尿病及骨質疏松均有調節作用，槲皮素[14]具有降糖作用，異鼠李素[15]可能抑制經典NF-κB通路對破骨細胞的分化具有抑制作用, 毛蕊異黃酮、芒柄花黃素可通過調節骨形態發生蛋白2的表達促進成骨細胞的成骨作用[16]，說明山奈酚、異鼠李素、槲皮素等13 個化合物可能是山藥黃芪藥對發揮抗T2DOP的活性化合物。度值排前三位的信號通路分別為PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路及雌激素信號通路，說明這些信號通路在調節T2DOP中起關鍵作用。

圖5 “山藥-黃芪”藥對治療T2DOP的 KEGG 信號通路分析

圖6 “山藥-黃芪”藥對中化學成分所對應的靶點與通路

3 討論

2 型糖尿病(T2DM)是一種以缺乏胰島素和高糖為特征的慢性代謝性疾病，占糖尿病患者的90%以上，可引起骨質疏松，導致T2DOP。T2DOP在T2DM并發癥中病發率最高可達60%[17-18]，西醫主要以對癥治療為主，然而糖尿病合并骨質疏松的發病機制比較復雜，早期癥狀不明顯，部分降糖西藥亦會影響到骨密度[19-20]，使其在防治中加大了難度。中醫藥作用的多靶點性在臨床治療復雜發病機制的T2DOP方面有一定的優勢，網絡藥理學以生物學網絡節點的連接和關系分析為基礎構建“化學成分-預測靶標-信號通路”的多層次網絡，然后綜合分析中藥復方的作用，既反映了中藥復方多成分、多靶點、多通路的特點，又與疾病結合起來，與中醫整體觀、辨證論治的基本原則相吻合。

通過檢索TCMSP 數據庫，山藥-黃芪藥對中含有OB>30 %且DL>0.18 %的化學成分36個，經過進一步檢索得到預測作用靶點698 個，T2DOP共得到3 305 個相關靶點，山藥黃芪化學成分-山藥黃芪候選靶基因與T2DOP相關靶標作用網絡圖中以大于該網絡的度中心性、接近中心性、中介中心性/中間中心性均值為篩選條件篩選出關鍵節點67 個，其中含有靶標40 個。以40 個靶標進行GO分析及KEGG 通路分析，結果表明，GO分析中有56個BP條目，10 個CC條目，21 個MF條目，結果表明山藥-黃芪藥對主要調節肽基絲氨酸磷酸化、調節細胞增殖、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、視黃酸的反應、轉錄、ERK1和ERK2級聯的正調控、子宮內胚胎發育、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、凋亡過程的負調控等生物過程。通路富集分析表明，主要影響對糖尿病和骨質疏松均有調節作用的卵巢類固醇生成及雌激素信號通路、糖尿病相關信號通路(松弛素信號通路、黏著斑、催乳素信號通路、甲狀腺素信號通路、內分泌抵抗、血小板活化[21]、FoxO信號通路[22])、與骨質疏松成骨作用相關的作用通路(脂肪細胞中脂解的調節、VEGF信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路)、與骨質疏松破骨作用相關的信號通路(鈣信號通路、細胞衰老、花生四烯酸代謝)、與骨質疏松骨成骨作用破骨作用均具有調節作用的PI3K-Akt信號通路[23-24]等。

這與文獻調研[25]不謀而合，雌激素可通過胰島β細胞中的雌激素受體促進胰島細胞存活，脂質穩態和胰島素的生物合成和分泌；雌激素同時是骨骼代謝的主要激素調節劑，雌激素缺乏會增強骨吸收，導致骨重建失衡，還可促進骨形成，提高骨密度，對糖尿病及骨質疏松均具有較好的調節作用。糖尿病從多方面影響骨的形成以及骨吸收過程，誘發骨質疏松，因此，干預糖尿病的發展可減緩骨質疏松的發展。研究報道，松弛素信號通路[26]、黏著斑[27]、催乳素信號通路[28]、甲狀腺素信號通路[29]對糖尿病均具有調節作用。骨代謝的穩態取決于成骨細胞誘導的骨形成和破骨細胞誘導的骨吸收之間的平衡。糖尿病性骨質疏松主要是由于成骨細胞和破骨細胞之間的不平衡導致骨形成減少，骨密度和骨強度受損，以及骨微結構的破壞。強化和恢復成骨細胞的成骨分化，重新平衡成骨細胞和破骨細胞的數量，可能有助于治療糖尿病性骨質疏松癥，如雙歧曲霉多糖引起抗骨質疏松作用的機制是由VEGF和OPG的上調介導的[30]；p53抑制成骨細胞增殖并增強成骨細胞凋亡，從而減少骨形成[31]；IL-17在骨質流失中起重要作用，IL-17促進了骨形成負調節劑硬化蛋白基因誘導的脂肪形成，并增強了對成骨的抑制作用[32]；NFATc1是破骨細胞分化的主要轉錄因子，可調控許多破骨細胞的特異功能基因，RANKL激活鈣信號通路，是激活NFATc1所必需的[33]；說明VEGF信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路等主要影響成骨作用，鈣信號通路等主要調節破骨細胞的功能。

綜上所述，本文采用網絡藥理學的分析方法探討山藥-黃芪藥對治療T2DOP的可能作用靶標及途徑，并建立“山藥黃芪藥對化學成分-靶標基因-信號通路”相互作用網絡圖，揭示了山藥黃芪藥對治療T2DOP的多維調控網絡，其中起主要作用的化學成分可能為山奈酚、異鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基異戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海風藤烯酮、芒柄花黃素、熊竹素、毛蕊異黃酮、異黃烷酮、蓽茇明寧堿、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 共13 個化合物，山藥黃芪藥對治療T2DOP的靶標可能主要為CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2 共15 個靶標，度值相對較高的信號通路為PI3K-Akt信號通路、鈣信號通路及雌激素信號通路，最終達到調節T2DOP的作用。