斑馬魚骨質疏松模型的研究應用

王曦悅 張秀艷 董馨 馬飛祥 劉杰 喬俊纏 薛培鳳*

1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010000

2.內蒙古自治區呼和浩特市蒙中醫院藥劑科，內蒙古 呼和浩特 010000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是由于多種原因引起的骨量丟失與降低、骨組織微結構破壞、骨脆性增加、骨密度(bone mineral density，BMD)下降從而導致患者易出現骨折的全身代謝性骨病[1-2]。患者最常見的臨床表現為腰背疼痛或全身骨痛，通常在姿勢改變時及長時間行走后出現，夜間或負重活動時疼痛加重，有可能出現行動受限，疼痛多為彌散性。其他臨床表現為骨折、脊柱變形等，嚴重者可能壓迫心肺，出現循環、呼吸系統的功能異常，且長時間會對患者造成巨大心理負擔[3]。一些早期的OP患者沒有癥狀或只有疼痛，往往會被人忽視，等到病情加重時常常已經發展到了較為嚴重的階段，所以OP又被稱為“寂靜的疾病”。目前OP的發病機制以及治療方法需要進一步研究，建立骨質疏松模型是進行發病機制及治療藥物研究的必要條件，根據研究需要，應盡可能選擇與人類相似度高、重復性好、經濟有效的模型。斑馬魚(zebrafish)作為現今常用模式生物，在骨骼疾病研究中，以獨特的結構與生理提供了靈活高效的動物模型。本文擬對OP研究現狀及斑馬魚骨質疏松模型建立方法和研究應用進行綜述，為相關實驗研究提供參考。

1 骨質疏松癥的研究現狀

骨質疏松癥可分為原發性、繼發性和特發性三大類[4]。不同類型的骨質疏松有不同的病因，是多種因素共同作用的結果[5]。 OP的具體分類和病因學研究見表1。骨骼發育涉及多種關鍵的生物學途徑或信號轉導通路，全基因組關聯研究報道了60多個影響BMD的位點,證實了BMD基因的多態性。由表1可看出OP涉及到其中多種關鍵的生物學途徑[11]，如Wnt信號通路、維生素D內分泌途徑、雌激素內分泌途徑、核因子κB受體活化因子-核因子κB受體活化因子配體-骨保護素(RANK-RNAKL-OPG)途徑等。

表1 骨質疏松癥按病因分類及病因學研究進展

2 斑馬魚骨質疏松模型的建立

斑馬魚的骨骼由軟骨和硬骨兩種不同的組織組成,與其他脊椎動物骨骼發育過程極其相似。軟骨由軟骨細胞形成,硬骨由成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(osteoclast，OC)組成，間充質細胞(mesenchymal cells，MSCs)是軟骨細胞和OB的共同起源，OC則起源于髓單核細胞系。斑馬魚的OB和OC都與哺乳動物具有相似的功能。和高等脊椎動物一樣，斑馬魚既有膜內成骨，即顱骨的形成是由OB直接形成骨骼；也有軟骨內骨化，是由OB和OC通過逐步替換軟骨模板的方式，從頭到尾的順序分體節在配卵后的2～3 d開始發育形成斑馬魚的脊椎骨骼[12-13]。

斑馬魚體型小，成熟周期短，繁殖效率高，其行為學特性易于觀察,可動態觀察生命健康狀態和病理變化表觀特征。斑馬魚基因與人類基因相似率可達到 87%。斑馬魚模型在基因轉錄與敲除等方面可塑性也比較強[14-15]。傳統上，斑馬魚突變系是通過正向遺傳篩選產生的，使用誘變劑[例如乙基亞硝基脲(ENU)]在后代中誘導隨機點突變，然后篩選出感興趣的表型[16-17]。現有的斑馬魚骨質疏松模型的建立方法都是將斑馬魚培養在適宜濃度造模藥物的生活環境中，處理一段周期后，使斑馬魚的骨密度發生改變。誘導斑馬魚建立骨質疏松癥模型的藥物見表2。現有的斑馬魚骨質疏松癥造模方法，使得斑馬魚骨質疏松模型的應用存在限制。

表2 斑馬魚骨質疏松模型的建立方法

目前研究斑馬魚骨骼模型的最常用方法是通過經典骨骼染色并在熒光顯微鏡下進行觀察。常用的化學染料有茜素紅(alizarin red)和鈣黃綠素(calcein)等。茜素紅染色為固定染色，通過與骨中的鈣結節引起的顯色現象來檢測魚的骨形態和BMD，毒性強具有特異性，用于斑馬魚硬骨染色,但實驗前期步驟較多,耗時較長。鈣黃綠素染色為活體染色，與骨骼中的鈣化離子結合，在熒光的照射下發出綠色熒光來顯示骨骼鈣化程度，熒光信號強、毒性弱、染色時間短,但無特異性，可以實時觀測胚胎骨所有時期的發育，需要注意染色過程要避光且要將染色液清洗干凈,防止對熒光信號產生影響[22]。活體熒光染色主要研究斑馬魚幼魚的骨骼鈣化及成魚尾鰭的再生等,而影像學技術也被用于斑馬魚骨骼的觀察，如X線檢測、顯微CT等，能夠更精準的評價骨的質量,更適用骨質疏松癥的早期檢測[23]。

3 斑馬魚骨質疏松模型的應用

3.1 斑馬魚骨質疏松模型在藥物活性篩選中的應用

在斑馬魚骨質疏松模型建立中常選野生型品系的斑馬魚，采用潑尼松龍或地塞米松造模，因其可以顯著抑制斑馬魚早期的骨骼發育形成[24]。徐宇等[25]分別用25、50、100 μg/mL 濃度的醋酸潑尼松龍造模,通過死亡率及脊椎熒光染色的個數來確定潑尼松龍對斑馬魚的最佳造模濃度為25 μg/mL。斑馬魚模型能快速、動態地觀察骨的早期發育，為大規模篩選抗骨質疏松藥物提供可能。斑馬魚骨質疏松模型抗骨質疏松藥物活性成分的篩選見表3。

表3 斑馬魚骨質疏松模型抗骨質疏松藥物活性成分的篩選

3.2 斑馬魚骨質疏松模型在藥物安全性中的應用

斑馬魚骨質疏松模型不僅可以快速篩選抗骨質疏松藥物，也可同時檢測藥物毒性。凌潔等[30]用高效液相色譜分析捕獲補骨脂成分/組分聯合潑尼松龍誘導的斑馬魚骨質疏松模型快速篩選抗骨質疏松活性成分，并同時考察死亡率，確定補骨脂酚毒性較大，高劑量會達到100%死亡率。王茉等[31]提出形成斑馬魚代謝-效應/毒性(M-Act /Tox) 一體化評價的新方法。葛靜等[32]基于斑馬魚代效毒一體化有效的評價箭葉淫羊藿的代謝、抗骨質疏松效應及毒性。實現化合物用量少(微克至毫克級)、微板中快速進行的兼顧體內外有效成分和安全性的高效系統篩選，為抗骨質疏松藥物篩選提供新的思路方法。

3.3 斑馬魚骨質疏松模型在研究作用機制中的應用

在斑馬魚骨質疏松模型研究藥物抗骨質疏松活性時，也可以聯合電感耦合等離子發射光譜串聯質譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、實時熒光定量核酸擴增檢測系統(quantitative real-time，qPCR)和分子對接技術等同時研究藥物作用機理，為藥物在人體的作用機制做出鋪墊。斑馬魚骨質疏松模型在研究藥物等作用機制中的應用見表4。

表4 斑馬魚骨質疏松模型在藥物藥效機制研究方面的應用

4 總結和展望

體外細胞藥物篩選模型可高通量、多指標、多靶點同時檢測,但是忽略了藥物在體內ADME等生理過程,因此篩選出的一些有效成分具有活性低、毒性高、生物利用度低等缺點。目前用于高通量藥物篩選的果蠅和線蟲模型可以滿足高通量、多靶點篩選,但不能反映脊椎動物的體內藥效過程。斑馬魚具有與人體相關性高、可以活體實驗、樣品用量少、篩選快、準確率高等優勢,在藥物活性成分或天然產物化合物的篩選等方面都有顯著優勢。但斑馬魚骨質疏松模型仍存在一定局限性：斑馬魚不是哺乳動物，體內臟器病理變化與哺乳動物有區別；斑馬魚軀體小，除骨染色觀察、其他檢測方法難以進行等。總體而言，對于骨質疏松癥及相關疾病的研究，斑馬魚模型仍然是最佳選擇，具有廣闊的研究市場。