不同改良措施對鹽堿土土壤細菌群落多樣性的影響

鄭敏娜， 梁秀芝， 韓志順， 康佳惠， 陳燕妮

(山西農業大學高寒區作物研究所， 山西 大同 037008)

大同盆地是我國北方農牧交錯帶的北界和雨養農業的下限區，是較典型的生態脆弱區，該區域蘇打型鹽堿地面積占比較大，蘇打含量高，但土地資源豐富，具有開發潛力，是農牧業發展的優先區域。據21年世紀初的調查數據顯示，隨著地下水位的整體下降，土壤鹽堿程度有所降低，但現存的蘇打型鹽堿地仍達到13.25 萬hm2，并且主要集中分布在山西省北部的大同盆地，這部分土壤養分含量低、保水保墑能力差、生產力低下，嚴重影響該區域農業生產和草牧業的可持續發展[1-2]。對于農田或草地生態系統來說，土壤微生物群落至關重要，土壤高鹽度會影響到土壤微生物群落結構及活性，嚴重制約土壤中氮素、磷素、鉀素的形態轉化，降低肥料利用率[3]。實施合理的改良措施會改變土壤pH和含鹽量，影響土壤微生物活性和養分轉化過程[4]，進而提高農作物或飼草產量和品質。

長期以來，添加外源改良物質被用作提升鹽堿地土壤肥力和作物生產力的重要管理措施[5]。眾多研究結果[6-8]表明，生物質炭、石膏在消減鹽堿障礙、提升土壤地力等方面有良好的效果。生物質炭疏松多孔，陽離子交換量大，富含有機碳，施入土壤中能有效調節土壤結構，促進微生物的代謝[8]；石膏類物質的主要成分為CaSO4·2H2O，其改良機制為增加土壤中Ca2+對土壤膠體上Na+的替換，提高土壤陽離子交換量和鹽基飽和度，減輕單鹽毒害，改善土壤鹽堿障礙[9]。在需要改良的鹽堿地投入外源改良劑并配施合理的肥料，不但可以刺激植物生長，引起土壤生物學特性的差異，而且可為微生物提供底物[4]，豐富微生物群落，進而影響土壤結構和土壤肥力[10]。此外，種植毛葉苕子(ViciavillosaRoth)這類豆科綠肥，也能在生長過程和還田過程中為土壤微生物提供能源與養分，引起土壤微生物的活性發生改變[11]等。

目前國內外關于改良劑和種植綠肥各自對于鹽堿地土壤理化性狀和微生物狀況的影響研究較多，但將二者同時運用到鹽堿土土壤改良中的研究較少。生物質碳、石膏類物質等作為化學改良手段，操作簡便、成本較低、改良效果最穩定；綠肥作為生物改良方式，投入成本降低，并且對土壤中微生物的豐度具有更顯著的影響[12]。因此，本研究將化學改良和生物改良方式相結合，開展了不同改良措施對土壤養分和土壤微生物群落功能多樣性的影響研究。

本試驗以山西省大同盆地山陰地區的中度鹽堿地為研究對象，在田間通過定位試驗，采用三代PacBio測序平臺，探討不同綜合改良措施下農田土壤細菌群落多樣性的差異狀況，并結合土壤養分狀況，優選出最佳治理模式，為大同盆地中度鹽堿地的治理和合理利用提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗地位于中國山西省朔州市山陰縣后所鄉后張堡村(39°25′28″ N，112°55′34″ E)，海拔920 m，該區域地處雁門關農牧交錯核心區，農業區劃為中溫帶干旱區；年均降雨量為350～600 mm，降水季節性分布不均，多集中于夏、秋季；年蒸發量大于1 600 mm，強烈蒸發期亦在春季和秋季；年均氣溫7.0℃，無霜期130 d左右；土壤屬堿化潮土，質地輕壤偏沙型，土壤中鈉吸附比值較高，鹽堿化程度較嚴重，經測定，樣地0～60 cm耕層土壤中平均含鹽量為2.12 g·kg-1，土壤容重為1.48 g·cm-3，pH值為9.13，土壤有機質含量為4.32 g·kg-1，堿化度為13.4%。

1.2 試驗設計

本試驗中青貯玉米(ZeamaysL.)品種為‘中玉88號’，綠肥選用毛葉苕子，由山西農業大學資源環境學院提供。生物質炭由江蘇溧陽生物質炭制備有限公司提供(原材料為秸稈稻殼，炭化溫度600℃，炭化時間20 S)，經測定其pH為9.48，有機質含量為689.12 g·kg-1，全氮含量為6.32 g·kg-1，全磷含量為6.12 g·kg-1；石膏(CaSO4)由大同市第二發電廠提供。

試驗于2018年—2020年進行，為青貯玉米-綠肥輪作定位試驗。試驗以內陸中度蘇打型鹽漬土(Z)為研究對象，設對照處理(CK，不施肥，單播青貯玉米)，并在此基礎上設置化肥+CaSO4+生物炭(L，單播青貯玉米),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC1，2行青貯玉米，2行綠肥),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC2，2行青貯玉米，3行綠肥),化肥+CaSO4+生物炭+綠肥(LC3，2行青貯玉米，4行綠肥)處理(表1)。其中：處理LC1，LC2，LC3為玉米和毛葉苕子間作，次年玉米種植帶和毛葉苕子種植帶進行輪換。試驗處理按照完全隨機的方式排列，小區面積為4.4 m×6 m，每個處理重復3次，共計15個小區。

表1 試驗各處理的具體信息Table 1 Specific information processed by the experiment

試驗期間，每年5月初進行播種。各小區，化肥(尿素，N：46.4%)施用量為385 kg·hm-2，CaSO4的施用量為4 500 kg·hm-2，生物炭的施用量為10 000 kg·hm-2，在播種前將各改良劑和肥料混勻后施入0～30 cm土壤。玉米播種密度為45 kg·hm-2，毛葉苕子播種量60 kg·hm-2，條播。其中，玉米種植帶間的行距為50 cm，毛葉苕子種植帶間及玉米與毛葉苕子之間的行距為30 cm。其他管理措施與當地的常規管理模式相同。

1.3 樣品采集與處理

于試驗第3年(2020年)毛葉苕子盛花期采集土壤樣品和植株樣品。各小區按對角線采樣法，在各個樣地內用土鉆采集0～30 cm土層土樣，每塊樣地內每個采樣點均為10點混合樣，先混合，再采用四分法取1 kg，3次重復。取樣后，將新鮮土壤樣品分成兩部分，其中一部分快速撿出植物根系、殘體和碎石等雜物后，置于試管中在—80℃保存，用于細菌高通量測序分析，剩余部分自然陰干后測定常規土壤理化性質。此外，每小區選取長勢較為一致的3 m×3 m樣方，測定地上部所有生物量。

1.4 測定方法

1.4.2土壤微生物DNA提取和測序 使用MN NucleoSpin 96 Soil(MN，Germany)試劑盒進行DNA的提取，按廠商說明從5組處理土壤樣品中提取土壤總DNA。將經上機檢測后DNA質量和濃度均合格的各樣品保存在-80℃條件下。在PacBio測序平臺上，以提取合格的土壤微生物DNA為模板，以細菌16S rRNA基因全長序列為目的片段進行PCR擴增，16S rRNA基因序列引物為27F (5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和反向1492R (5′-ASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)。擴增體系為：KOD FX Neo Buf (2X) 25 μL，60 ng基因組DNA 3 μL，KOD FX Neo (TOYOBO)1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，2Mm dNTP 10 μL，加ddH2O補充至總體系50 μL。使用AxyPrep DNA Gel Extraction kit (Axygen，USA)提取擴增產物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據電泳結果，用Image J軟件進行定量，定量后按照質量比1∶1進行混樣，并用0.8 X磁珠進行回收純化。純化后用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0試劑盒構建測序文庫并在PacBio RS II上進行測序(北京百邁克生物公司測序)。

1.4.3測序數據處理 對原始下機subreads進行校正得到CCS(Circular Consensus Sequencing)序列(SMRT Link，version 8.0),然后使用lima (v1.7.0)軟件，通過barcode序列識別不同樣品的CCS序列并去除嵌合體(UCHIME,version 8.1)，得到符合以下標準的高質量的CCS序列：①最小通過率(minPasses)≥5；②最小預測精確度(minPredictedAccuracy)≥0.9；③序列長度閾值為1 200 ～1 650 bp。在相似性97%的水平上對序列進行聚類(USEARCH，version 10.0)，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU。

應用QIIME(v1.7.0)平臺，對獲得的高質量序列進行生物信息學分析?；贠TU分析結果，對各樣品在各個分類水平(門、綱、科、目、屬、種)上進行分類學分析；利用Mothur v.1.30軟件和R語言工具進行α多樣性分析(Ace、Chao1、Shannon、coverage)；利用軟件QIIME進行β多樣性分析，包括主坐標分析(Principal Coordinat Analysis，PCoA)、樣品層次聚類(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)、熱圖(Heatmap)等。線性判別分析(Linear discriminant analysis effect size，LEfSe，http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)根據分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析(LDA)，找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種。利用STAMP和R軟件進行組間差異分析等。

1.4.4統計分析 利用Microsoft Excel 2009進行數據整理，采用SPSS 22.0軟件用單因素方差分析不同處理之間的差異顯著性(P<0.05)；采用Pearson法進行相關性分析，并使用R語言分析作圖。

2 結果與分析

2.1 不同改良措施對土壤養分的調控作用

表2 不同改良措施下土壤理化性質和生物量情況Table 2 Physical and chemical properties of soil and biomass under different improvement measures

2.2 不同改良措施對土壤細菌序列及其多樣性指數的影響

本研究利用PacBio SMRT測序技術對所有土壤樣品的微生物菌群進行了解析，測序結果顯示，在所有土壤樣品中，總共獲得206 906條序列讀數，平均每個樣本含有13 794條序列，序列平均長度為1 454 bp，所有樣本中序列最少的9 739條，最多的含有14 989條，除去短的、重復、低質量和嵌合體之外，保留了205 676個有效序列。基于97%的相似性，在所有樣品中獲得總共2 036個OTU，劃分為30個門，51個綱，103個目，151個科，284個屬。

本研究計算了5個不同處理下所有樣本的Chao1，Ace，Shannon指數(表3)，試驗結果表明，所有處理的覆蓋指數均大于0.9900，這也說明測序能力能夠比較真實地反映土壤樣本的細菌群落特征。與CK處理相比，LC1處理中觀察到的OTU數量增加了11.70%(P<0.05)。LC1處理的Shannon多樣性指數最高(6.38)，與L處理間差異顯著(P<0.05)，與其他3個處理間差異不顯著。Ace指數亦以LC1處理的最高(1769.19)，與CK和L處理間差異顯著(P<0.05)。Chao1指數以LC1處理的最高(1735.32)，比CK和L處理高7.77%和9.66%。

表3 不同改良措施處理下土壤細菌測序及群落α多樣性指數Table 3 Bacterial sequencing and community α diversity index of soil treated with different improvement measures

2.3 不同改良措施對細菌群落組成的影響

在門水平上共得到30個類群，根據從所有樣品中獲得的序列，鑒定了前8個主要門，分別是變形菌門(Proteobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidota)，芽單胞菌門(Gemmatimonadota)，放線菌門(Actinobacteriota)，酸桿菌門(Acidobacteriota)，浮霉菌門(Planctomycetota)，黏球菌門(Myxococcota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)，它們占細菌群落相對豐度的80.00%以上(圖1A)。在這些占優勢的門中，變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度占比最高，以LC2處理中相對豐度最高，為50.83%，CK處理中相對豐度最低，為41.25%；擬桿菌門(Bacteroidota)的相對豐富度占比次之，在LC1和LC3處理中相對豐度分別為10.92% 和10.64%，在LC2處理中相對豐度僅為6.94%；芽單胞菌門(Gemmatimonadota)在CK處理中相對豐度最高，為10.94%；放線菌門(Actinobacteriota)在L和LC1處理中相對豐度較高，分別為4.73%和4.63%，在CK處理中相對豐度占比最小，僅為3.41%。

為了更詳細地分析與不同改良措施下相關的細菌分類情況，本研究確定了屬級的細菌組成情況(圖1B)。在屬水平上共有284個類群被分類，其中，CK處理中，芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和Longimicrobium是主要屬，相對豐度分別占處理序列的4.51%和4.17%；L處理中Longimicrobium和溶桿菌屬(Lysobacter)相對豐度較高，分別占序列的4.95%和3.62%；LC1處理中Longimicrobium和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度占比最大，分別為4.54%和3.88%；此外，溶桿菌屬(Lysobacter)在LC2和LC3處理中相對豐度均占比最大，分別為4.89%和4.16%。

在種的水平上共有344 個類群被分類，其中平均相對豐度大于1%的有5個類群(圖1C)，分別是Longimicrobium_terra，嗜酸溶桿菌(Lysobacter_rhizophius)，Vicinamibacter_silvestris，Gemmatimonas_sp和伯拉吉亞藤黃單胞菌(Luteimonas_pelagia)。種水平上未被分類的細菌種類占比較大，相對豐度平均為49.49%。

圖1 不同改良措施下細菌門(A),屬(B),種(C)的組成結構Fig.1 Relative abundance of bacteria (A) at the phylum level and bacteria (B) at the genus level and species level (C) in the different treatment samples

2.4 不同改良措施下細菌群落差異分析

根據系統類型和系統發育狀況，比較了各處理所有土壤樣品中的細菌組成(圖2)。考慮到系統型差異的UPGMA，并結合每個樣本的97%的序列同一性，發現L處理和LC1處理間支長較近，說明這2個樣品中物種的組成最為相似；而CK與L，LC1處理間支長較遠，說明CK與L，LC1處理樣品中的物種組成上存在明顯差異(圖2A)。為了與UPGMA結果進行比較，采用主坐標分析(PCoA)測定了每組土壤樣品中細菌的系統發育距離，得到了相似的微生物簇(圖2B)。其中，第一和第二主坐標(PC)表明，物種累積百分比方差分別占22.39%和19.34%，累計41.73%物種差異可用這兩個軸來解釋。從PCoA分析結果可以看出，不同的改良措施下形成了不同的細菌群落，而且CK與L，LC1，LC3處理間存在明顯差異。

為了進一步確定與不同改良措施相關的特定細菌分類群，根據分類學組成對各處理(CK，L，LC1，LC2，LC3處理中的細菌群落)樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析。進化圖(圖3)中不同分類級別的每個圓圈表示該級別的分類，黃色表示豐度沒有顯著變化，圓形直徑的大小表示相對豐度。根據設定的篩選標準(LDA score > 4)，發現17個細菌進化支在統計學上有顯著差異(P<0.05，圖3)。根據LEfSe的LDA的分析結果顯示(圖3)，與其他處理相比，L處理中LEfSe檢測到更多的細菌分類群(6個進化支，1個門，2個目，1個科，1個屬和1個種)，即髕骨細菌門(Patescibacteria)、噬纖維菌目(Cytophagales)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)、黃色單胞菌科(Xanthomonadaceae)、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、伯拉吉亞藤黃單胞菌(Luteimonaspelagia)。在LC1處理中鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)的相對豐度顯著高于其他處理；LC2處理中的根瘤菌目(Rhizobialea)相對豐度顯著高于其他處理；LC3處理中富集了目水平的幾丁質噬菌體目(Chitinophaglaes)和伯克氏菌目(Burkholderiales)，科水平的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)，屬水平的Flavisolibacter等；相比之下，在CK中則富集了較多數量的芽胞菌目(Gemmatimonadales)菌群(圖3)。

2.5 不同改良措施的細菌群落結構及其與環境因子的關系

在屬水平上，采用微生物相對豐度的熱圖進一步直觀地來表達樣品中群落結構狀況(圖4)。在熱圖中，紅色和藍色分別代表較高和較低的相對豐度，可將5個處理下的樣品劃分為3組，第一組包括L和LC1，第二組僅有LC2，第三組包括CK，LC3，這與圖2A分析結果較為一致。在不同改良措施下，對于L處理的樣品，優勢細菌種類包括Longimicrobium，藤黃單胞菌屬(Luteimonas)；LC1樣品中的優勢細菌種類為Flavisolibacter，鞘脂單胞菌屬(Sphingomomas)；LC2樣品中的優勢細菌種類為硝化螺旋菌屬(Nitrospira)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，溶桿菌屬(Lysobacter)；LC3樣品中優勢細菌種類為Tepidisphaera，溶桿菌屬(Lysobacter)，艾德昂菌屬(Ideonella)；CK樣品中的優勢細菌種類則為芽單胞菌屬(Gemmatimonas)。從以上不同處理的優勢細菌種類可以看出，不同的改良措施使得土壤微環境發生了不同程度的改變，這些環境因素的變化對群落中不同微生物群的貢獻各不相同。

圖2 不同改良措施下土壤細菌群落的UPGMA圖(A)和PLS-DA圖(B)Fig.2 Unweighted pair-group method with arithmetic means analysis and PLS-DA diagram of soil bacterial community with different treatment

圖3 不同改良措施下土壤細菌群落系統發育樹Fig.3 The cladogram of soil bacterial community under different treatments

圖4 各處理在屬水平上的細菌群落熱圖分析Fig.4 Bacterial community heatmap analysis at genus-level phylotype with different treatment

圖5 屬水平上不同改良措施處理的土壤細菌的相對豐度和土壤環境因子間的RDA分析Fig.5 Canonical correspondence analysis (RDA) based on the relative abundance of bacterial at genus level and environmental factors among different treatments注：TN，全氮；TP，全磷；Na+，鈉離子；Ca2+，鈣離子；Cl-，氯離子；碳酸氫根離子Note:TN indicate total nitrogen;TP indicate total indiacte salt-based ions

3 討論

在土壤中，微生物群落的生物多樣性和豐富性對于土壤生態系統的功能性和可持續性至關重要[4，16]。許多研究已經證實，任何農業改良措施都會不同程度地促使土壤微生物群落的多樣性和豐富度發生改變[22-23]。在本研究中發現實施不同改良措施后，與CK相比，各處理的豐富度指數(Ace)有明顯增加(表3)，而細菌群落多樣性(Shannon指數)在不同處理之間沒有顯著變化，這與前人的研究結果類似[24-25]。這可能是由于施用改良劑或種植豆科植物后對土壤理化性質和微生物群落產生了明顯的影響，試驗中，所用生物質炭主要是秸稈焚燒的產物，其結構能增加土壤孔隙度，促進鹽分淋洗；石膏的主要成分是CaSO4，通常呈酸性，施用于土壤后pH值趨于中性，并且石膏和生物質炭含有的大量的Ca2+和Mg2+置換土壤膠體上的Na+，促進土壤團粒結構的形成[22]；而種植的毛葉苕子是優良的豆科牧草，其根部會富集更多的具有固氮功能的細菌，例如在LC1和LC3處理中富集了Flavisolibacter，LC2處理中富集了根瘤菌目(Rhizobialea)等。因此，改良劑或種植豆科植物在土壤中的施用能顯著改變微生物種群，進而影響微生物群落的一系列活動。

不同措施的農業擾動，不但在一定程度上改變細菌豐富度及多樣性，而且還可能會促使土壤微生物群落結構和成分發生變化。對于鹽堿土來說，鹽度和堿度會是影響其土壤中微生物群落結構的顯著因素，在鹽堿土壤中可能會分布著大量的喜鹽堿細菌，變形菌門中的變形菌綱是鹽堿土壤的主要類群[26-27]，其余優勢菌群會有擬桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門等這些嗜鹽菌[28-29]，這些類群在本研究中均有發現，且屬于前10位的優勢菌門。在本研究中變形菌門(Proteobacteria)是細菌門中占比最大的一類門，其門中包括了固氮(例如根瘤菌目Rhizobialea)和各類代謝物(例如黃色單胞菌屬Luteimonas)的細菌，而擬桿菌門具有溶磷作用，與磷素的轉化利用密切相關[4]，有研究表明[4]變形菌門、擬桿菌門相對豐度在富營養水平下表現為增加，本研究中除LC2處理中擬桿菌門的相對豐度低于對照(CK)外，其余各處理的相對豐度豐度均高于對照(CK)，與前人研究結論部分相似。芽單胞菌門(Gemmatimonadota)在實施改良措施的各處理中相對豐度均明顯下降，這與王丹[30]、王超[31]研究結果一致。而放線菌門(Actinobacteriota)則在有機物分解和抵抗病原微生物侵害的過程中起著關鍵作用[4]，各處理中的相對豐度均明顯高于對照。此外，本研究中酸桿菌門,(Acidobacteriota),浮霉菌門(Planctomycetota),黏球菌門(Myxococcota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)的相對豐度均占比在1%以上，它們在本研究的土壤生態系統中也起著重要作用，但具體作用有待進一步研究。

土壤微生物群落結構與功能會在改良措施實施程度和持續時間的共同作用下表現出不同的響應策略。土壤改良和恢復是一個比較緩慢的過程，為了使改良劑、肥料、植物與土壤的融合過程達到最大效果，本研究進行了為期3年的定位試驗。通過3年改良，每個處理的土壤環境均發生了一定程度的改變，土壤微生物群落結構和功能也會隨之發生一定變化。根據本試驗結果，PCoA分析清楚地區分了不同改良措施下土壤細菌微生物群落之間的差異(圖2B)。在試驗中，LC1，LC3處理中觀察到較豐富的Flavisolibacter(圖3)，與其他土壤微生物相比更能在根部有效的定殖、對有害微生物具有拮抗作用；LC2樣品中較豐富的Rhizobialea(目)，是與植物共生固氮的主要類群，假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)具有迅速分解土壤中腐殖質能力[32-33]；而科水平的黃色單胞菌(Luteimonas)在L處理富集，LEfSe的分析還表明在L處理下檢測到更多的分類群，生物菌群最為豐富，但這些微生物進化枝與病原微生物密切相關，不利于土壤培肥。此外，在研究中出現的鞘脂桿菌科(Sphingomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、叢毛單胞菌屬(Comamonasdaaceae)等優勢菌則為具有脫氮除磷功能的反硝化菌和異養硝化細菌[34-35]。從各處理的優勢菌群分布中可以看出，LC1，LC2，LC3等3個處理優化了鹽堿地微生物的群落結構，顯著提高土壤微生物群落功能多樣，有利于鹽堿地土壤的正向演替。此外，改良措施對土壤影響引起的環境因素變化對群落中不同微生物群的貢獻不同(圖5)，在本試驗中，RDA揭示出TN，TP，SOM，Na+，Cl-含量對處理土壤中的細菌群落組成有著更為顯著的影響。

4 結論

本研究通過不同改良措施下鹽堿地土壤化學性質及細菌群落進行分析，發現常規施肥下添加生物質炭和CaSO4且以2∶2間作種植毛葉苕子和青貯玉米的處理(LC1)不僅降低了土壤電導率，增加了銨態氮和硝態氮的含量，而且明顯提高了土壤細菌群落的Ace指數、地上生物量和變形菌門的相對豐度。常規施肥下添加生物質炭和CaSO4及種植2行綠肥對鹽堿地土壤的改良效果最好，其優勢菌群更有利于土壤培肥，且地上生物產量最高。然而，不同改良措施對土壤菌群及微環境的具體影響機制還有待進一步深入研究。