外源激素對染白粉菌草地早熟禾葉片膜透性及表面結構的影響

朱 琨， 劉麗杰， 周 璐， 李珊珊， 范震宇， 吳紀一， 尼 尼

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

草坪在美化環境、調節小氣候、凈化空氣、保持水土等方面占據重要地位[1]。隨著草坪需求量逐漸增加，草坪草病蟲害已成為影響草坪坪用特性和可持續利用的主要因素[2-3]。白粉病是草坪草的常見病害之一，廣泛分布于世界各地，病害加劇嚴重降低草坪的觀賞價值，導致草坪早衰和毀壞。

草地早熟禾白粉病的病原物為子囊菌亞門、白粉菌目、白粉菌科、白粉菌屬、禾布氏白粉菌，菌絲體葉表寄生[4]。受侵染的草葉表呈灰白色小塊病斑，隨著病情的加劇，逐漸擴大成灰褐色的近圓形絨絮狀霉斑，后期霉層中形成小黑粒，與此同時葉片變黃，最終導致枯萎死亡[5]。植物抗病誘導劑是一類新型植物殺菌劑，屬于綠色環保的生物農藥，可誘導植物產生局部或系統的抗性[6]。有研究證實，外源激素對植物抗生物和非生物脅迫中具有重要作用[7]。然而，外源激素誘導染白粉菌草地早熟禾葉片膜透性及表面結構的研究報道較少。為此，本試驗選取易感病的草地早熟禾品種‘超級哥來德’為材料，研究外源SA，ABA和JA對染白粉菌草地早熟禾的抗性誘導，膜透性及表面結構，為進一步研究外源激素對草地早熟禾白粉病的抗性機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取草地早熟禾品種‘超級哥來德’(Poapratensis‘Ever Glade’)為供試材料，由北京克勞沃集團提供。病原菌為禾布氏白粉病菌(Blumeriagraminis)，在齊齊哈爾大學植物栽培實訓基地采集并鑒定。

1.2 試驗設計

選擇飽滿、健康的草地早熟禾種子，用砂培法種植，每個穴苗盤種植約0.3 g種子，期間用1/2 Hoagland營養液培養；在(25±1)℃的溫室栽培管理，光周期為光照16 h/黑暗8 h；光照強度為6 000 lx；相對濕度約50%。試驗采用隨機區組設計，對3種外源激素分別設6個處理，其中SA濃度為0(CK)，10，20，30，100，200 mg·L-1；ABA濃度為0(CK)，10，20，30，40，50 mg·L-1；JA濃度為0(CK)，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol·L-1，每個處理設3次重復，草地早熟禾生長40 d后，每天傍晚均勻地噴施激素，以葉面上密布一層溶液而不滴為度，連續噴施3 d。將采集的白粉病菌孢子用毛筆輕輕刷入無菌水中，將病菌孢子配成 106個·mL-1的懸浮液，并向其中加入2%的吐溫-20表面活性劑后進行噴霧接種，將配置好的孢子懸浮液均勻噴施在草地早熟禾葉片上，接種10 d后觀察統計發病情況和隨機采樣，進行下一步試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1病情調查與統計 病級標準參照田麗波等[8]的方法：0級：無病斑；1級：少量細小模糊的白粉斑，病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級：白粉層薄，病斑面積占整個葉面積的6%～10%；5級：白粉層較厚，病斑面積占整個葉面積的11%～20%；7級：白粉層厚，病斑面積占整個葉面積的21%～40%；9級：白粉層厚，病斑面積占整個葉面積的40%以上。

病情指數=Σ(各級病葉數×病級數)/(調查總葉片數×最高病級數)×100

發病率(%)=發病葉片數/調查總葉數×100%

誘導抗病率=(對照發病率-處理發病率)/對照發病率×100%

1.3.2膜透性相關生理指標的測定 相對電導率的測定參照李合生[9]的方法；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[10]。

老的讓開道，催促著，獎勵著，讓他們走去。路上有深淵，便用那個死填平了，讓他們走去。 [2](第1卷，P354-355)

相對電導率(%)=R1/R2×100%

式中，R1為抽氣和吸水后測定溶液電導率；R2為再放入恒溫水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫再測定溶液電導率。

丙二醛含量(μmol·g-1FW)=[6.45×(D532-D600)-0.56×D450]×提取液總體積/(測定用提取液體積×樣品鮮重)

1.3.3葉表結構觀察和測定 用HITACHI(S-3400 N)掃描電鏡對不同外源激素處理的染白粉菌草地早熟禾葉片進行葉表結構觀察，每個處理選取10個視野，觀察并測量葉片的氣孔和乳突的各項指標。

氣孔長寬比=氣孔長度/氣孔寬度

氣孔密度=視野氣孔數(平均)/視野面積

乳突密度=視野乳突數(平均)/視野面積

1.4 數據分析

SPSS 22.0數據處理軟件進行數據統計和分析，采取單因素方差分析和Duncan’s檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 外源激素對草地早熟禾抗白粉病的誘導效應

2.1.1外源SA的誘導作用 由表1可知，SA濃度為10～200 mg·L-1處理的草地早熟禾與CK相比，均可顯著降低草地早熟禾白粉病的病情指數和發病率(P< 0.05)，且隨著SA濃度增加總體呈現先降低后升高的趨勢。當SA濃度為100 mg·L-1時草地早熟禾的病情指數和發病率最低，和CK相比發病率降低21.60%，病情指數下調17.77%，抗病效果提升23.46%，但與200 mg·L-1處理相比，病情指數和發病率差異不顯著，抗病效果顯著降低3.59%(P< 0.05)。因此，100 mg·L-1SA濃度誘導草地早熟禾對白粉病產生的抗性最強。

表1 SA對草地早熟禾抗白粉病的誘導效應Table 1 Induction effects of SA on powdery mildew resistance of Poa pratensis

2.1.2外源ABA的誘導作用 由表2可知，ABA濃度為20～40 mg·L-1處理的草地早熟禾與CK相比，均可顯著降低草地早熟禾白粉病的病情指數和發病率(P< 0.05)，且隨著ABA濃度增加總體呈現先降低后升高的趨勢，當濃度為20 mg·L-1時草地早熟禾的病情指數和發病率最低，分別為30.35%和68.32%，誘導抗病效果達25.71%，顯著高于其他處理(P<0.05)。由此可見，20 mg·L-1ABA濃度誘導草地早熟禾對白粉病產生的抗性最強。

表2 ABA對草地早熟禾抗白粉病的誘導效應Table 2 Induction effects of ABA on powdery mildew resistance of Poa pratensis

2.1.3外源JA的誘導作用 由表3可知，JA濃度為 0.1～2.0 mmol·L-1處理的草地早熟禾與CK相比，均可顯著降低草地早熟禾白粉病的病情指數和發病率(P< 0.05)，且隨著JA濃度增加總體呈現先降低后升高的趨勢，當1.5 mmol·L-1JA濃度處理后，病情指數和發病率均顯著低于CK和其他處理，分別為25.38%和56.49%，誘導抗病效果顯著高于其他處理(P< 0.05)，誘導抗病效果可達38.70%，但將JA濃度增加到2.0 mmol·L-1與1.5 mmol·L-1處理相比，病情指數、發病率和防治效果差異顯著(P< 0.05)，病情指數和發病率分別升高6.88%和22.13%，防治效果降低24.03%。由此可見，1.5 mmol·L-1JA濃度誘導草地早熟禾對白粉病產生的抗性最強。

表3 JA對草地早熟禾抗白粉病的誘導效應Table3 Induction effects of JA on powdery mildew resistance of Poa pratensis

2.2 外源激素對染白粉菌草地早熟禾葉片膜透性物質的影響

2.2.1外源SA的影響 與CK處理的草地早熟禾相比，隨著SA濃度的增加，草地早熟禾葉片相對電導率含量呈先下降后上升的趨勢(圖1-A)。當SA濃度為100 mg·L-1時，葉片相對電導率(相比于CK)下降最明顯，緩解白粉病對草地早熟禾葉片膜透性的傷害作用最強，但SA濃度再加大至200 mg·L-1時緩解作用有所減弱。誘導SA濃度為10 mg·L-1時，葉片相對電導率與CK的差異不顯著，而其它誘導濃度，與CK的葉片相對電導率含量差異顯著(P< 0.05)，均有緩解作用。

與CK處理的草地早熟禾相比，在SA低濃度(0～30 mg·L-1)過程中，草地早熟禾葉片MDA含量差異不顯著，且有升高趨勢(圖1-B)。SA濃度為20 mg·L-1和30 mg·L-1時，MDA含量與CK相比MDA含量稍有增高。當SA濃度為100 mg·L-1時(相比于CK)，MDA含量下降最多(P< 0.05)，說明細胞膜質過氧化程度降低最明顯，緩解細胞膜受傷害作用最強。但當SA濃度再加大至200 mg·L-1時緩解作用有所減弱。

圖1 不同濃度SA對草地早熟禾葉片相對電導率和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of SA with different concentrations on relative conductivity and malondialdehyde content of Poa pratensis leaves

2.2.2外源ABA的影響 隨著ABA濃度的增加，草地早熟禾葉片相對電導率呈先下降后上升的趨勢(圖2-A)。濃度為10，20，30，40和50 mg·L-1ABA處理，均能使葉片相對電導率下降，且顯著低于CK(P< 0.05)。其中20 mg·L-1ABA處理的效果較好，葉片相對電導率下降最明顯，緩解白粉病對草地早熟禾葉片的膜透性傷害作用最強。

與CK處理的草地早熟禾相比，隨著ABA濃度的增加，草地早熟禾葉片MDA含量顯著低于對照(CK)，且呈先降低后升高趨勢(圖2-B)。當濃度為20 mg·L-1ABA處理時，葉片MDA含量下降最明顯，細胞膜質過氧化程度和細胞膜受傷害的程度均為最低。當濃度為30，40，50 mg·L-1ABA處理時，與20 mg·L-1ABA處理相比MDA含量均有升高，且隨著ABA處理濃度增加MDA含量逐漸增加。

圖2 不同濃度ABA對草地早熟禾葉片相對電導率和丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of ABA with different concentrations on relative conductivity and malondialdehyde content of Poa pratensis leaves

2.2.3外源JA的影響 與CK處理的草地早熟禾相比，隨著JA濃度的增加，草地早熟禾葉片相對電導率呈先下降后上升的趨勢(圖3-A)。誘導濃度為0.1，0.5和1.0 mmol·L-1時，葉片相對電導率的差異不顯著；當JA濃度為1.5 mmol·L-1時，葉片相對電導率下降最明顯，緩解白粉病對草地早熟禾葉片膜透性的傷害作用的效果最好，但濃度再加大至2.0 mmol·L-1時緩解作用有所減弱。

與CK處理的草地早熟禾相比，隨著JA濃度的增加，草地早熟禾葉片MDA含量均顯著低于對照(CK)，且呈先降低后升高趨勢(圖3-B)。當濃度為1.5 mmol·L-1JA處理時，葉片MDA含量下降最明顯，緩解作用最強。濃度為2.0 mmol·L-1與 1.5 mmol·L-1JA處理相比MDA含量增加，緩解細胞膜受傷害的程度減弱。

圖3 不同濃度JA對草地早熟禾葉片相對電導率和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of JA with different concentrations on relative conductivity and malondialdehyde content of Poa pratensis leaves

2.3 外源激素對染白粉菌草地早熟禾葉片表面結構的影響

利用掃描電鏡對染白粉菌和激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片進行表面結構觀測分析，氣孔形狀近長圓形，染白粉菌草地早熟禾葉片的氣孔密度為92.14 個·mm-2(圖4B)，激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片的氣孔密度為85.42 個·mm-2(圖4A)。與染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔(圖4C)對比發現，經外源激素誘導后染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔顏色加深，下陷加重(圖4D)；氣孔長度和氣孔寬度的變化無規律；3種外源激素不同濃度處理后所得氣孔長寬比與CK相比，都有不同程度下降(見表4)。染白粉菌草地早熟禾葉片的乳突密度為22.41 個·mm-2(圖4B)，激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片乳突密度為19.12 個·mm-2(圖4A)；染白粉菌草地早熟禾葉片乳突呈圓柱狀，其特征是尖端銳利而向頂(圖4F)；激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片乳突呈長圓柱狀，其特征是向頂逐漸變尖(圖4E)，有效加大乳突投影面積。

圖4 草地早熟禾葉片掃描電鏡圖Fig. 4 SEM photos of Poa pratensis leaves注：A為激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片(200×)，B為染白粉菌草地早熟禾葉片(200×)，C為染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔(1000×)，D為激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔(1000×)，E為激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片乳突(1000×)，F為染白粉菌草地早熟禾葉片乳突(1000×)Note:A，hormone treat the leaves of Poa pratensis infected by Powdery Mildew(200×);B，the leaves of Poa pratensis infected by Powdery Mildew(200×);C，the stomas of Poa pratensis infected by Powdery Mildew(1000×);D，hormone treat the stomas of Poa pratensis infected by Powdery Mildew(1000×);E，hormone treat the papillaes of Poa pratensis leaves infected by Powdery Mildew(1000×);F,the papillaes of Poa pratensis leaves infected by Powdery Mildew

表4 不同外源激素對染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔的影響Table 4 Effects of different exogenous hormones on Poa pratensis stomas infected by powdery mildew

3 討論

3.1 外源激素誘導草地早熟禾抗病性

外源激素可以增強一些植物對細菌、真菌和病毒等病原物的抗性[11]。單一激素或多種激素互作，誘導寄主植物的抗病效果存在差異[12-14]。單一外源SA可誘導染白粉病豌豆(PisumsativumL.)自身產生抗性[15]。本試驗通過對染白粉菌草地早熟禾噴施外源SA，ABA和JA，再次證實單一外源SA，ABA或JA均可誘導染白粉菌草地早熟禾增強抗病性；比較分析得出3種外源激素中JA誘導草地早熟禾對白粉病抗病效果最佳，但誘導抗病效果僅達到38.70%。而趙澤花等人研究指出茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，Me-JA)誘導草地早熟禾后接種白粉病菌抗病效果可達64.99%[16]。染白粉病黃瓜‘長春密刺’經SA，ABA和Me-JA處理后，再次證實Me-JA誘導抗病效果最佳[17]。Me-JA可以在植物細胞質中被酯酶水解為JA，可能因其實現了長距離的信號傳導和植物間的交流，致使染白粉菌草地早熟禾經Me-JA誘導后的抗病效果優于JA誘導后的抗病效果。噴施外源SA，ABA，(ABA+SA)處理冬小麥，其中(ABA+SA)混合處理組對冬小麥的抗寒性以及返青率提高效果最佳[18]，由此可知，外源激素混合處理對增強冬小麥抗性優于單一激素處理。多種外源激素混合處理對草地早熟禾抗白粉病的效應是否會優于單一激素處理，還有待于進一步研究。

3.2 外源激素調控草地早熟禾葉片細胞膜透性

植物激素是一種植物生長調節物質，能調控植物的一系列防御反應[19-22]。外源激素調控植物體內MDA含量變化，體現細胞膜系統受傷害程度和膜質過氧化程度，可用來判定植物的抗性強弱[23-24]。柳莉利用1.5 mmol·L-1的SA或0.1 mmol·L-1的ABA預處理自然感染白粉菌的攜帶內生真菌醉馬草(AchnatheruminebriansKeng)，顯著地降低葉片中MDA的含量(P< 0.05)，細胞膜質過氧化的程度較低，使得細胞膜受傷害較少[25]。本試驗中發現，單一外源SA，ABA或JA(與CK相比)對染白粉菌草地早熟禾的MDA含量均有降低作用，表明細胞膜質過氧化程度降低，減少對細胞膜的傷害，可提高草地早熟禾抗白粉病性。這與趙澤花[16]的研究結果相一致，經外源激素Me-JA誘導MDA含量減少，降低膜脂過氧化程度，保護質膜，進而減少病菌對其傷害，提高草地早熟禾對白粉病的抗性。相對電導率是衡量細胞膜透性的重要指標，其值越大，表示電解質的滲漏量越多，細胞膜受害程度越重[26]。外源SA對干旱脅迫下金蓮花生長有一定緩解效果，隨著SA處理濃度的增加，相對電導率呈現先下降后升高趨勢[27]，這與本試驗SA處理草地早熟禾葉片相對電導率變化趨勢相一致，說明外源激素在一定濃度范圍內可對植物細胞膜透性起到保護作用，從而減少離子外流，降低電導率。本試驗中外源激素SA，ABA和JA處理均可降低染白粉菌草地早熟禾葉片相對電導率含量，穩定細胞膜結構和功能，減少電解質滲漏，提高抗病性；葉片相對電導率含量降低依次為JA > ABA > SA，表明選擇適宜的激素種類和濃度可大幅度降低草地早熟禾葉片相對電導率含量，增強草地早熟禾的白粉病抗性。

3.3 外源激素誘導草地早熟禾抗白粉病與葉片表面結構的關系

氣孔可響應環境刺激調控植物水分蒸騰和物質交換[28]。氣孔密度與植株的蒸騰強度和光合作用等生理過程密切相關[29]。作為葉表皮上的天然開孔，許多病原菌可通過氣孔入侵到植物體內[8]。然而，植物也可以主動關閉氣孔來阻止病原菌的入侵，實現抗病免疫[30]。本研究中通過掃描電鏡觀測發現，外源激素處理染白粉菌草地早熟禾葉片氣孔顏色加深且凹陷加劇，這可能是一種抵擋白粉病菌侵入的方式，對延遲和抵御病原菌入侵有一定作用，有利于提高草地早熟禾抗病性。但抗白粉病性與其氣孔長度、寬度、長寬比及密度間未表現出相關性。

當病原菌穿過抗性寄主植物細胞壁的過程中，會伴隨碳水化合物和纖維素的積累，形成圓頂形突起，即乳突[31]。它能有效延遲病原菌進入細胞，并很大程度上阻止其穿透細胞。馬青[32]研究發現，經寡聚糖誘導黃瓜葉片后，可以使黃瓜對白粉菌抗病性提高，主要通過產生細胞壁加厚和多層次結構的乳突來實現。本試驗發現，外源激素誘導染白粉菌草地早熟禾，乳突形狀由圓柱狀變為長圓柱狀，向頂逐漸變尖，有效加大乳突投影面積，這將有利于提高抗病性。

4 結論

3種外源激素的適宜濃度(與CK相比)分別為水楊酸濃度100 mg·L-1，脫落酸濃度20 mg·L-1，茉莉酸濃度1.5 mmol·L-1，均能有效降低草地早熟禾染白粉菌的病情指數和發病率；相對電導率和MDA含量下降最明顯，細胞膜質過氧化程度降低，減少對細胞膜的傷害，提高草地早熟禾抗白粉病性，減少白粉病對草地早熟禾葉片細胞膜透性的損壞。3種外源激素中，1.5 mmol·L-1濃度茉莉酸誘導抗病效果最佳。外源激素誘導染白粉菌草地早熟禾葉片的氣孔顏色加深且凹陷加劇、乳突投影面積加大，有利于提高草地早熟禾抗病性。