接種根瘤菌對重茬豌豆植株生長及光合特性的影響

張旭輝， 馬紹英， 馬 蕾， 楊 寧， 王 娜， 張維霞， 連榮芳， 李 勝*， 柴 強*

(1.甘肅農業大學生命科學技術學院， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業大學基礎實驗教學中心， 甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學農學院， 甘肅 蘭州 730070； 4.定西市農業科學研究院， 甘肅 定西 743000)

豌豆(PisumsativumL.)屬豆科植物，具有生育期短、適應性強、分布廣泛等特點，且含有大量維生素、胡蘿卜素和蛋白質等多種營養成分，是重要的養地倒茬作物。但豌豆易發生重茬障礙，研究發現重茬種植導致豌豆幼苗活性氧大量積累，造成膜脂過氧化，抑制豌豆幼苗生長，導致生物量降低[1]，同時土壤中病原菌數量增加，加重病害的發生，進而影響豌豆的產量[2]。因此，解決重茬障礙對于提高豌豆的產量至關重要。

根瘤菌(Rhizobium)可與豆科植物共生，將空氣中的氮氣轉化為植物可以利用的化合態氮。研究發現，固氮體系可為豆科作物提供50%～90%的氮素營養，極大程度的減少氮肥的施用，防止土壤酸化的發生[3]。近年來，人們發現利用有效的根瘤菌接種劑可提高豆科作物的滲透調節能力和抗氧化能力，增加葉綠素含量，增強光合作用，顯著提高豆科作物產量和農業生產力[4-5]。接種根瘤菌不僅影響豆科作物自身的生長發育，還可通過改變土壤微環境間接影響豆科作物的生長。研究發現，接種根瘤菌增加了土壤酶活性以及全氮、有機質含量，為作物的生長提供有利環境[6-7]。此外，有研究表明接種根瘤菌可提高豆科作物對非生物脅迫的耐受性[8-9]。但對于忌連作豆科作物的相關研究報道較少，已有的研究主要集中于對大豆、花生等重茬障礙成因等的研究，對利用根瘤菌緩解連作障礙的研究報道較少。因此本研究以豌豆為試驗材料，研究重茬種植條件下接種單一及混合根瘤菌對豌豆植株生長及光合特性的影響，以期為緩解豌豆重茬障礙提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試豌豆品種：抗旱性品種‘定豌8號’(D8)，生育期90 d左右，百粒重21.30 g，由定西市農業科學研究院提供；干旱敏感性品種‘隴豌6號’(L6)，生育期84 d左右，百粒重22.10 g，由甘肅省農業科學院提供。

供試菌種：豌豆根瘤菌‘ACCC15657’(Rhizobiumleguminosarum‘ACCC15657’)和‘ACCC15735’(Rhizobiumleguminosarum‘ACCC15735’)由中國農業微生物菌種保藏中心提供；苜蓿根瘤菌‘Wa32’由甘肅農業大學草業學院提供。

1.2 試驗處理及方法

1.2.1根瘤菌的培養 將保藏的根瘤菌在無菌條件下接種于酵母甘露醇瓊脂(Yeast mannitol agar，YMA)培養基上進行活化擴增培養。活化2代后接種于YMA液體培養基中，在180 r·min-1和28℃的恒溫搖床中培養至對數生長期，并將供試菌株的菌液在600 nm的OD值均調至0.8時作為接種菌液[1]。

1.2.2種子萌發 挑選大小一致、顆粒飽滿的豌豆種子置于廣口瓶中，流水沖洗30 min，用無菌水浸泡2 h后，于無菌操作臺用75%酒精進行表面消毒30 s，用5%(V/V)NaClO浸泡6 min，無菌水沖洗種子3～4次，將種子均勻放于鋪設了滅菌濾紙的培養皿中，添加適量無菌水，于23℃的光照培養箱中黑暗培養至發芽，篩選未污染且發芽一致的種子進行盆栽播種。

1.2.3蛭石及花盆滅菌 蛭石用流水沖洗，再用蒸餾水沖洗，置于100℃干燥培養箱高溫烘干至恒重，然后置于高壓滅菌鍋滅菌2 h；花盆用5% (V/V)NaClO浸泡30 min，沖去殘留的NaClO，于紫外燈下照射2 h。

1.2.4試驗方法 2019年4月15日豌豆正茬種植于甘肅農業大學基礎實驗教學中心，室內溫度為25℃，光強約450 μmol·m-2·s-1。

2020年4月20日在同一地點以種植正茬保留的蛭石為基質，以盆栽的方式進行豌豆的重茬種植，處理方式如下：挑選發芽正常且大小一致的豌豆種子于單一根瘤菌液‘ACCC15657’(R1)，‘ACCC15735’(R2)，‘Wa32’(R3)和混合菌液‘ACCC15657’+‘ACCC15735’(R4)，‘ACCC15657’+‘Wa32’(R5)，‘ACCC15735’+‘Wa32’(R6)，‘ACCC15657’+‘ACCC15735’+‘Wa32’(R7)中浸泡30 min(混合菌處理為不同菌液同濃度等比例混合，各處理菌液總量相同)，同時以YMA液體培養基浸泡豌豆種子作為對照(CK)。將處理好的豌豆種子種于盆缽大小為180 mm ×90 mm，裝有2.5 kg蛭石的花盆中，每盆定植5顆種子，播種深度為3 cm，每盆施加Fahraeus無氮營養液200 mL。播種6 d后，幼苗子葉展開，第一片真葉挺出后沿幼苗根部補澆相應菌液5 mL，對照同上澆灌YMA液體培養基。

為消除邊際效應，每天調整花盆的位置。在生長期間每隔4 d澆灌一次蒸餾水150 mL，澆2次蒸餾水后第3次澆灌150 mL營養液以補充營養，依次循環，培養30 d進行苗期采樣測定，90 d成熟期采樣并保留栽培基質。

1.3 測定指標及方法

1.3.1生物量的測定 取樣后將豌豆植株的地上部和地下部分開，于105℃殺青30 min，80℃烘至恒重，稱重地上部分和地下部分的生物量，同時計算根冠比[10]。根冠比=地下干重/地上干重。

1.3.2葉綠素含量的測定 采用TYS-B葉綠素測定儀(浙江托普云農科技股份有限公司生產)測定豌豆葉片的葉綠素相對含量即SPAD值，選取豌豆自上而下第3片葉測定葉綠素相對含量，每處理隨機選5株植株，求其平均值[11]。

1.3.3光合參數的測定 在晴朗的天氣采用CI-340手持式光合測定儀(美國CID公司生產)測定，采用開放式氣路，于早上9∶00—11∶00測定見光一致的自上而下第3片展開葉，測定光強約450 μmol·m-2·s-1，溫度為(25±1)℃，每處理隨機選5株，求其平均值。測定指標包括凈光合速率(Net photosynthetic rate，Pn)，氣孔導度(Stomatal conductance，Gs)，蒸騰速率(Transpiration rate，Tr)，胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration，Ci)[12]。

1.4 抗重茬能力評價方法

應用模糊數學中的隸屬函數值法對各指標進行綜合評價，隸屬函數值計算公式：

R(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

R(X)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中:X為指標測定值，Xmin和Xmax分別為2個豌豆品種所測某一指標的最小值和最大值。如果該指標與抗重茬能力呈正相關，則采用(1)式計算隸屬值，如果相反，則用(2)式計算。將抗逆隸屬函數值進行累加，并求得平均值，平均值越大，抗逆性越強[8]。

1.5 數據處理

利用Microsoft Office Excel 2016對試驗數據進行整理，用SPSS 22.0軟件對不同菌種處理差異數據進行單因素方差分析，并進行Duncan差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 接種根瘤菌對重茬豌豆植株生長特性的影響

2.1.1對株高的影響 植物形態指標的變化趨勢能夠直觀地反映不同水平處理對植物生長的影響[13]。重茬種植及接種根瘤菌后豌豆植株株高的變化如表1所示，不接菌條件下重茬豌豆植株株高低于正茬處理。其中，L6 CK2較CK1在苗期和成熟期株高分別降低了14.4%和8.7%，D8的分別降低了14.4%和16.8%(P<0.05)。接種不同菌處理相較于CK2對兩種豌豆植株株高具有不同程度的促進作用(L6成熟期R7除外)，L6在苗期單接種R2處理促進效果最佳，較CK2增加30.7%(P<0.05)，成熟期混合接種R4處理促進作用效果最佳，較CK2增加20.8%(P<0.05)；D8在苗期混合接種R7處理促進效果最佳，較CK2增加了37.6%(P<0.05)，成熟期R5處理效果最佳，較CK2增加了58.1%(P<0.05)。

綜上所述，重茬種植降低了豌豆株高，接種根瘤菌處理增加了2個品種豌豆植株株高，但單一菌種和混合菌種對兩種豌豆不同時期的影響不同，L6植株苗期接種單一菌種對株高促進效果較好，而L6成熟期、D8苗期和成熟期接種混合根瘤菌效果較好。

2.1.2對根冠比和地上部生物量的影響 根冠比反映了根系與地上部之間干物質積累的關系，它受遺傳因素決定，也受到環境的影響[14]。如表2所示，L6苗期CK2較CK1根冠比增加了36.9%(P<0.05)，成熟期降低了24.9%(P<0.05)；D8 CK2較CK1豌豆植株根冠比在苗期和成熟期分別增加了46.0%和36.2%(P<0.05)。接種不同根瘤菌處理對兩種豌豆植株根冠比在不同時期有不同影響，L6接種根瘤菌較CK2處理重茬種植在苗期根冠比有降低的趨勢，在成熟期根冠比增加(R2除外)，且接種R4較CK2處理增加了75.0%(P<0.05)；D8苗期重茬種植接種根瘤菌處理較CK2差異不顯著(R2除外)；成熟期接種根瘤菌較CK2有降低根冠比的趨勢(CK2除外)。

由此可知，不接菌條件下重茬種植根冠比顯著高于正茬種植(L6成熟期除外)，接種根瘤菌對兩種豌豆不同時期的根冠比影響不同。

表1 接種根瘤菌重茬豌豆植株株高的變化Table 1 Changes of plant height of pea plants inoculated with rhizoba 單位：cm

表2 接種根瘤菌重茬豌豆植株根冠比的變化Table 2 Change of root-to-shoot ratio of pea plants inoculated with rhizobia

植物可以根據自身所處逆境條件的變化調節各構件之間的生物量分配，以適應環境的變化，因此生物量能直觀地反映植物生長與脅迫程度之間的關系[15]。由表3可知，兩種豌豆植株苗期地上部生物量重茬低于正茬，L6和D8在不接菌條件下重茬較正茬分別降低了18.2%和35.3%(P<0.05)；而成熟期地上部生物量重茬高于正茬。不同品種不同時期地上部生物量對接種根瘤菌的響應不同，L6苗期R5處理地上部生物量顯著增加30.4%(P<0.05)，成熟期接種根瘤菌與CK2相比有降低豌豆植株生物量的趨勢(R3除外)；D8苗期豌豆植株接菌處理增加了地上部生物量，混合接種效果好于單一菌種處理，其中R7處理較CK2地上部生物量增加了44.1%(P<0.05)，成熟期接種R4處理較CK2增加了25.0%(P<0.05)。

綜上，苗期2個品種豌豆在不接菌條件下重茬種植地上部生物量低于正茬，成熟期地上部生物量重茬高于正茬，接種混合根瘤菌顯著增加了D8苗期地上部生物量。

表3 接種根瘤菌重茬豌豆植株地上部生物量的變化Table 3 Changes of aboveground biomass of pea plants inoculated with rhizobia 單位：g

2.2 接種根瘤菌對重茬豌豆植株葉綠素含量的影響

葉綠素的含量與植物光合作用及氮素營養有密切的關系[15]。如表4所示，兩種豌豆植株在不同時期重茬較正茬種植，葉綠素含量有升高的趨勢。兩種豌豆植株葉綠素含量對接菌處理的響應不同，L6苗期接種根瘤菌較CK2處理有降低葉綠素含量的趨勢，成熟期接種根瘤菌較CK2處理增加了葉綠素含量，接菌R1和R7處理葉綠素含量較CK2分別增加了13.2%和10.7%(P<0.05)；D8苗期R1較CK2增加了12.9%(P<0.05)，成熟期接種混合根瘤菌R4和R7較CK2處理葉綠素含量分別增加了17.2%和19.4%(P<0.05)。

表4 接種根瘤菌重茬豌豆植株葉綠素含量(SPAD)的變化Table 4 Changes of chlorophyll content in pea plants inoculated with rhizobium 單位：SPAD

2.3 接種根瘤菌對重茬豌豆植株光合氣體交換參數的影響

2.3.1對凈光合速率的影響 凈光合速率(Pn)在一定程度上決定著植物生長速度的快慢，決定了植物吸收CO2釋放O2的能力，體現了植物對于物質積累的能力[15]。由表5可知，L6苗期和D8成熟期Pn值CK2顯著低于CK1，L6苗期CK2較CK1降低了29.4%(P<0.05)，D8成熟期CK2較CK1降低了61.4%(P<0.05)。接菌處理有增加Pn值的趨勢(L6成熟期除外)，L6苗期和成熟期接種R1處理Pn值最高，較CK2分別增加了117.2%和79.9%(P<0.05)；D8重茬種植時，苗期單一菌R1和混合菌R4處理較CK2分別增加了55.7%和93.7%(P<0.05)，成熟期單一菌R1和混合菌R6處理較CK2分別增加了124.6%和93.1%(P<0.05)。

表5 接種根瘤菌重茬豌豆植株凈光合速率(Pn)的變化Table 5 Changes of net photosynthetic rate (Pn) of pea plants inoculated with rhizobium 單位：μmol·m-2·s-1

2.3.2對氣孔導度的影響 氣孔導度(Gs)是影響植物光合作用、呼吸作用及蒸騰作用的主要因素[16]。由表6可知，L6苗期和D8成熟期Gs CK2顯著低于CK1，L6苗期CK2較CK1降低了47.7%(P<0.05)，D8成熟期CK2較CK1降低了64.5% (P<0.05)。接種根瘤菌有增加Gs值的趨勢(D8苗期除外)，L6苗期重茬種植Gs值以R5處理最高，較CK2處理增加了260.5% (P<0.05)；成熟期R1處理較CK2增加了210.5%(P<0.05)；D8苗期接菌處理有降低Gs的趨勢，成熟期接菌較CK2處理Gs值增加(P<0.05)，單一菌R1和混合菌R5處理Gs值分別增加了362.2%和372.0% (P<0.05)。

綜上，重茬種植降低了豌豆植株Gs值，接種根瘤菌有增加Gs值的趨勢，單接種以R1處理促進效果最佳，混合接種以R5處理促進效果最佳。

表6 接種根瘤菌重茬豌豆植株氣孔導度(Gs)的變化Table 6 Changes of stomatal conductance (Gs) of pea plants inoculated with rhizobia 單位：mmol·m-2·s-1

2.3.3對蒸騰速率的影響 蒸騰速率(Tr)是定量衡量植物蒸騰特性的重要指標之一[17]。由表7可知，兩種豌豆植株在成熟期Tr CK2顯著低于CK1，L6 CK2較CK1降低了16.4%(P<0.05)，D8 CK2較CK1降低了75.5%(P<0.05)。接菌處理有增加Tr的趨勢(D8苗期除外)，L6苗期R3處理較CK2增加了171.6%(P<0.05)，成熟期R1處理較CK2處理增加了136.0%；D8重茬種植時，苗期接菌處理Tr值降低，成熟期接菌Tr值升高，R1處理效果最佳，R1較CK2增加了504.8%(P<0.05)。

表7 接種根瘤菌重茬豌豆葉片蒸騰速率(Tr)的變化Table 7 Changes of transpiration rate (Tr) of pea leaves inoculated with rhizobia 單位：mmol·m-2·s-1

2.3.4對胞間二氧化碳濃度的影響 在光合作用的氣孔限制分析中，胞間二氧化碳濃度(Ci)的變化方向是確定光合速率變化的主要原因和是否為氣孔因素的必不可少的判斷依據[18]。由表8可知，兩種豌豆植株Ci值在苗期CK2顯著高于CK1，成熟期CK2 Ci值顯著低于CK1。接種根瘤菌處理Ci值增加(D8苗期除外)，L6苗期接種混合根瘤菌R7處理效果最佳，較CK2處理Ci值增加了15.8%(P<0.05)，成熟期R3處理較CK2增加了39.2%(P<0.05)；D8苗期接菌R4處理較CK2下降幅度最大，下降了26.5%(P<0.05)；成熟期接菌R2處理較CK2增加了210.3%(P<0.05)。

表8 接種根瘤菌豌豆植株胞間二氧化碳濃度(Ci)的變化 Table 8 Changes of intercellular carbon dioxide concentration (Ci) of pea plants inoculated with rhizobia 單位：μmol·mol-1

2.4 重茬種植條件下不同菌種混合對兩個豌豆品種綜合指數效應的隸屬函數分析

如表9，10所示，對所測生長指標和光合參數進行模糊隸屬函數綜合分析并進行抗逆能力綜合評價，由此可知，‘隴豌6號’單接種R1處理的綜合評價值最高，混合接種R5處理次之；‘定豌8號’混合接菌R4處理效果最好，單接種R1處理次之。綜合評價值越大表明其抗逆性越強，其中，單接種‘ACCC15657’顯著提高‘隴豌6號’抗重茬能力，‘ACCC15657’+‘ACCC15735’顯著提高了‘定豌8號’的抗重茬能力。

表9 ‘隴豌6號’生長指標及光合參數指標的平均隸屬函數值Table 9 Average membership function values of growth and photosynthetic parameters of ‘Longwan 6’

表10 ‘定豌8號’生長指標及光合參數指標的平均隸屬函數值Table 10 Average membership function value of growth index and photosynthetic parameter index of ‘Dingwan 8’

3 討論

重茬障礙是許多作物普遍發生的現象，連續種植某些作物會導致這些作物生長受到抑制，進而影響產量和品質。本研究結果表明，重茬種植條件下豌豆植株在各生育期株高降低、根冠比增加，地上部生物量在苗期降低。說明重茬種植抑制了豌豆植株的生長，此結果與許艷麗等人[19]在大豆連作中的研究結果一致，重茬豌豆病蟲害加重，磷、鉀等營養元素失衡，水分脅迫較重，內源生長素等的含量及比例的變化導致冠部降低幅度大于根系，最終使根冠比增大，從而導致植株生長發育受到抑制[20]。重茬種植處理下‘隴豌6號’苗期和‘定豌8號’成熟期的凈光合速率值降低，這表明重茬種植抑制了豌豆植株的光合作用，影響植株對光能的轉化利用，從而導致生物量的降低。

本研究發現接種根瘤菌后提高了豌豆植株株高、地上部生物量，這與前人在豌豆[9]、紫花苜蓿[21-22]中的研究結果相似。這可能是根瘤菌能夠通過與豆科植物的共生關系將空氣中的氮轉化為生物可利用的氮形式，促進了植物生長，增強了宿主對重茬障礙的抵抗力[23]。接種根瘤菌處理后較不接菌處理‘隴豌6號’植株Pn，Gs，Tr及Ci均有增加的趨勢。這一結果與周相娟[24]、劉淑霞[25]等人研究結果相似，這可能是由于接種根瘤菌后，增加了土壤中根瘤菌的數量，增強了根瘤菌與豌豆根系共生結瘤能力，從而固定較多的氮素供植物吸收利用，而氮是植物葉綠素的重要組成元素，氮素缺乏，導致葉綠素合成受阻，進而影響光合作用[26]。重茬障礙的重要原因是土壤養分的失衡，接種根瘤菌可增加對植株的氮素供應，進而提高葉綠素含量，增強光合作用，增加豌豆植株的生物量。但不同菌種對不同品種豌豆的抗重茬能力不同，通過隸屬函數綜合分析發現，接種根瘤菌處理效果總體好于不接菌處理。其中，接種單一菌對L6的效果較為顯著，而接種復合根瘤菌對D8的效果較為顯著，這可能是由于豌豆品種間的差異以及與根瘤菌之間匹配性的差異引起的共生效果的不同。在各接菌處理中，L6與根瘤菌R1匹配性更強，這可能是L6中根瘤菌R1在與其他菌共存時存在對營養及生態位的競爭，削弱了自身與寄主植物的共生能力，使得混合接種效果弱于單接種；而在D8中R1和R2混合接種后匹配性更強，出現所謂的“互補效應”，即兩種單一菌株相互組合后比任何單獨施用菌株更有效的利用空間資源，但具體的作用機制還有待進一步研究。

重茬障礙的形成及加重的原因是十分復雜的，并不是單一因素所導致的，本研究僅探究了重茬條件下接種根瘤菌對豌豆植株的光合生理的影響，但重茬條件下外源根瘤菌與豌豆植株的互作機制以及植株的結瘤固氮效率的變化機理還有待進一步深入探究，從而為更有效的緩解豌豆連作障礙提供理論依據。

4 結論

重茬種植使豌豆植株生長受到抑制，接種根瘤菌能夠有效減輕豌豆植株重茬種植受到的抑制程度，但存在明顯的菌種、豌豆品種差異，‘隴豌6號’接種‘ACCC15657’效果最佳，‘定豌8號’接種‘ACCC15657’+‘ACCC15735’ 效果最佳。因此，選擇與豌豆匹配性好的根瘤菌是有效緩解其抗重茬障礙的關鍵因素之一。