水通道蛋白3在大鼠結腸黏膜中的表達

劉耀文　曾玉娟　瞿丹　粟慧敏　陳行　徐賽群

摘要：目的：探討水通道蛋白3（aquaporins，AQP3） 在大鼠結腸黏膜中的表達。方法：挑選10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，體重（200±50） g，雌雄各半，并將動物麻醉處死后取近端結腸和遠端結腸組織，用冰PBS溶液沖洗干凈后分成三部分，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的組織放入4 %多聚甲醛中進行固定，石蠟包埋后制備組織切片（厚度4 ?m） 。結果：RT-PCR結果表明在近端結腸和遠端結腸有豐富的AQP3 mRNA表達，且遠端結腸AQP3 mRNA表達明顯高于近端結腸AQP3 mRNA表達;Westernblot來檢測大鼠結腸AQP3蛋白的表達，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做標準化。結果顯示近端結腸有兩條AQP3條帶：一條位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一條位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而遠端結腸僅有一條位于30-40 kDa的糖基化的AQP3條帶。定量結果顯示近端結腸和遠端結腸有豐富的AQP3表達;免疫組化來檢測大鼠消化系統AQP3的定位。在大鼠結腸中AQP3主要表達單層柱狀上皮;且在近端結腸和遠端結腸，AQP3常表達于表面吸收上皮細胞的基底側膜上和腸隱窩的頸部。結論：AQP3表達于單層柱狀上皮細胞（近端結腸和遠端結腸） 的基底側膜上。

關鍵詞：AQP3;AQP3 mRNA;結腸黏膜

水通道蛋白（aquaporins，AQPs） 是一類存在于細胞膜的小分子蛋白，在動植物體內廣泛表達。AQP3廣泛表達于消化系統、呼吸系統、泌尿系統和皮膚系統的上皮組織中。AQP3陰性的小鼠中角質層水合作用減少，皮膚的彈性降低。消化系統中也可能有類似的作用[1]。另一個可能作用是指向固有層的跨上皮液體流動，作為小腸中水吸收的機制。AQP3基因敲除小鼠存在腸上皮細胞增殖受損和單核細胞功能存在缺陷，提示AQP3不僅在感染和炎癥狀態下對免疫功能有著重要的調節作用，而且對腸上皮細胞增殖起重要的作用[2]。因此，本文采取real-time PCR、westernblot和免疫組化實驗來系統性的驗證AQP3在正常結腸中的表達量。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物及飼養環境

10只Sprague-Dawley（SD） 大鼠，體重（200±50） g，雌雄各半。飼養于長沙醫學院動物實驗中心。實驗室相對濕度保持在40 %～60 %，實驗大鼠統一置于22～25℃的溫度下進行飼養，光照充足，安靜衛生，通風良好。10只大鼠單籠飼養，飼料充足，實驗大鼠可自由攝取清潔飲水，實驗操作嚴格遵守《湖南省實驗動物管理條例》。

1.2 主要藥品與試劑

AQP3抗體（兔抗大鼠） 、PCR試劑盒、二步法免疫組化檢測試劑。智能水分測定儀TMP-300 S，石蠟切片機LEICA CM1850，光學顯微鏡CX31，LightCycler96熒光定量PCR儀（顯微照相機BX-50） ，電子分析天平METTLER-AB304-S。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

動物麻醉處死后取近端結腸和遠端結腸組織，用冰PBS溶液沖洗干凈后分成三部分，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取RNA，一部分置于凍存管中-70℃保存用于提取蛋白，剩余的組織放入4 %多聚甲醛中進行固定，石蠟包埋后制備組織切片（厚度4 ?m） 。

1.3.2 RT-PCR檢測大鼠結腸組織AQP3的表達

首先將組織石蠟切片脫臘，3 %H2 O2室溫孵30 min，然后PBS沖洗，滴加10 %正常山羊血清封閉液37℃孵育30 min;加入一抗兔抗大鼠抗體（1：100稀釋） 孵育，PBS沖洗，滴加二抗山羊抗兔IgG孵育，PBS沖洗，滴加試劑辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP） 孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照：一抗用PBS代替。陽性細胞胞漿呈棕褐色。結果判定：染色指數=染色強度積分×染色面積比。染色強度積分，按顯色強弱記錄為：陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強陽性3分。染色面積比為腺體中染色細胞數占總體細胞數的百分比。

1.3.3 Westernblot檢測結腸AQP3蛋白的表達

取大鼠結腸組織分別放于玻璃勻漿器中，按照1：10加入裂解液，0℃下進行勻漿，4℃裂解30 min，4℃12000 r/min離心30 min，取上清液備用。BCA法測定蛋白含量后上樣（蛋白濃度每孔50 ug） ，每孔20 uL，加入緩沖液，100℃下水浴5 min使蛋白充分變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ，將蛋白質電轉移到聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上。5 %脫脂牛奶封閉后，加入一抗（AQP3，1∶300） ，4℃過夜，TBST洗膜3次，10分鐘/次，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，10分鐘/次，ECL試劑與膜作用后，Bio-Rad公司圖像攝取系統曝光，采集圖像并進行分析。計算AQP3與tubulin產物A積分的比值，實驗重復3次。

1.3.4 結腸組織AQP3 mRNA表達

將結腸標本放入液氮預冷的研缽中研磨，按照常規方法提取總RNA，然后用RT-PCR方法測定各組大鼠結腸組織AQP3基因的mRNA，進行相對表達量分析。

RT-PCR引物序列：AQP3上游引物：5'-TGGTGGCTTCCTCACCATCAA-3'，下游引物：5'-AGAGCCCAAAAACAATCCCAGC-3'，擴增片段長度為209 bp;β-actina上游引物：5'-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3'，下游引物：5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3'，擴增片段長度為592 bp。

1.4 統計學處理

應用SPSS 23.0軟件對臨床資料進行統計分析，計數資料用（%） 表示，行χ²檢驗;計量資料用（x±s） 表示，行t檢驗。P < 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸AQP3 mRNA的表達

RT-PCR結果表明在近端結腸和遠端結腸有豐富的AQP3 mRNA表達，且遠端結腸AQP3 mRNA表達明顯高于近端結腸AQP3 mRNA表達。

2.2 大鼠結腸AQP3蛋白的表達

采用Westernblot來檢測大鼠結腸AQP3蛋白的表達，AQP3的光密度值除以β-Actin的光密度值用以做標準化。結果顯示近端結腸有兩條AQP3條帶：一條位于27 kDa，代表未糖基化的AQP3;另一條位于30-40 kDa，代表糖基化的AQP3。而遠端結腸僅有一條位于30-40 kDa的糖基化的AQP3條帶。定量結果顯示近端結腸和遠端結腸有豐富的AQP3表達。

2.3 大鼠結腸AQP3免疫組化染色

采用免疫組化來檢測大鼠消化系統AQP3的定位。在大鼠結腸中AQP3主要表達單層柱狀上皮;且在近端結腸和遠端結腸，AQP3常表達于表面吸收上皮細胞的基底側膜上和腸隱窩的頸部。具體見下圖。

3 討論

Agre研究發現，水通道蛋白（Aquaporin，AQP） 廣泛分布在哺乳動物和植物細胞膜上，是一組與水通道有關的細胞膜轉運蛋白，是影響水的跨膜轉運和細胞內外環境平衡調節的主要蛋白，并因此獲2003年諾貝爾化學獎。迄今為止已從哺乳動物中鑒定并克隆了11種水通道蛋白（AQP0-AQP10） [3]。水通道蛋白是一類相對分子量為20～30 kD左右膜蛋白的大家族，每一種水通道蛋白均含6個跨膜區及細胞內氨基和羧基末端的蛋白質。Verkman成功建立了AQP1、3、4、5基因敲除鼠模型，系統研究AQP對腎臟濃縮功能的影響，對肺水腫和腦水腫等的影響。國內學者已做了類似的研究，但至今未見AQP對腹瀉病影響的研究報道，特別是有關AQP3對腹瀉病的相關研究，國內外更未見報道。

AQP3從腎臟中分離獲得，定位于腎集合管主細胞的基底膜上，和頂端膜上的AQP2共同參與對水的重吸收[4]。AQP3的表達通過高滲和高張而上調，其是水甘油通道蛋白的一員，允許水、尿素和甘油的通過。我們檢測了AQP3在大鼠結腸的免疫組化定位。AQP3表達于單層上皮細胞。AQP3可能的作用就是為上皮細胞補充水分，為這些上皮細胞面臨惡劣的環境等。

參考文獻

[1]張靜霞，黎兆軍.AQP3在皮膚病發病機制中的作用研究進展[J].醫學綜述，2013，19（17）：3.

[2]張迪，蘇維恒，趙元，等.水通道蛋白AQP3缺失對小鼠坐骨神經損傷修復的影響[J].中國獸醫雜志，2017，53（10）：4.

[3]張玉婷，張琪，郭抗抗，等.水通道蛋白在動物疾病發生過程中的作用研究進展[J].動物醫學進展，2021，42（3）：4.

[4]張冬梅，許鐘鎬，辛麗，等.AQP1、AQP2和AQP3在腎小球疾病腎組織中的表達及其意義[J].中國免疫學雜志，2009，25（1）：3.