脾氣虛大鼠肝臟細胞線粒體蛋白質控的研究

王藝璇 劉文俊 許欣竹 馬麗娜 陳文娜 宋囡 單德紅

【摘要】 目的：觀察肝細胞線粒體結構和功能及其蛋白質控，探討肝耐受脾氣虛的可能機制。方法：16只SPF級雄性SD大鼠根據隨機數字表法平均分成兩組，即8只正常組（對照組）和8只脾氣虛組（模型組）。透射電鏡觀察肝細胞線粒體結構，比色法和JC-1法分別檢測肝組織ATP和肝細胞線粒體膜電位（membrane membrane potential， MMP），Western blot法檢測肝細胞線粒體熱休克蛋白（hot shock protein， HSP）70、Lon蛋白酶（Lon protease， LonP）以及酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease， Clp）XP復合物等表達。結果：兩組線粒體大量分布于細胞核附近，形態相似，均呈卵圓形，邊緣清楚，內部致密，未見到明顯異常變化。與正常組相比，模型組ATP和MMP水平均下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。與正常組相比，模型組HSP70、ClpX、ClpP表達均上升，LonP表達下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。結論：肝耐受脾氣虛的機制與肝細胞線粒體蛋白質控機制增強有關。

【關鍵詞】 脾氣虛 線粒體 HSP70蛋白 Lon蛋白酶 ClpXP復合物

Study on Mitochondrial Protein Control of Liver Cells in Spleen Qi Deficiency Rats/WANG Yixuan， LIU Wenjun， XU Xinzhu， MA Lina， CHEN Wenna， SONG Nan， SHAN Dehong. //Medical Innovation of China， 2021， 18（14）： 0-022

[Abstract] Objective： To observe the structure， function and protein control of hepatocyte mitochondria and explore the possible mechanism of liver tolerance to spleen qi deficiency. Method： A total of 16 SPF male SD rats were divided into two groups according to random number table method， namely 8 normal group （control group） and 8 spleen qi deficiency group （model group）. The mitochondrial structure of liver cells was observed by transmission electron microscopy. The ATP of liver tissue and the mitochondrial membrane potential （MMP） of liver cells were detected by colorimetric method and JC-1 method， respectively. Western blot was used to detect expressions of hot shock protein （HSP70）， Lon protease （LonP） and caseinolytic protease （Clp） XP complex. Result： A large number of mitochondria in the two groups were distributed near the nucleus， and the morphology was similar， with oval shape， clear edge and dense interior， and no obvious abnormal changes were observed. Compared with the normal group， the levels of ATP and MMP in the model group were decreased， the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the normal group， the expressions of HSP70， ClpX and ClpP in the model group were all increased， while the expression of LonP was decreased， the differences were statistically significant （P<0.01）. Conclusion： The mechanism of liver tolerance to spleen qi deficiency is related to the enhancement of the quality control mechanism of mitochondrial protein in liver cells.

[Key words] Spleen qi deficiency Mitochondron Hot shock protein 70 protein Lon protease ClpXP complex

First-authors address： Graduate School， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.005

傳統中醫理論認為肝木克脾土，特別是脾虛易為肝乘，即“土虛木乘”，還指出脾氣虛能擾肝，如“脾氣虛則四支不用，五臟不安”。由此可知脾氣虛不能改變肝克脾的規律，或者說肝對脾氣虛具有一定的耐受性，但其現代醫學機制不明。中西醫對肝的形態描述基本一致，如位于腹腔右脅內、右葉大和左葉小等。現代醫學認為肝臟是物質代謝的關鍵部位，而線粒體不僅是肝細胞的動力工廠，還廣泛參與生物合成、信號轉導和胞內鈣穩態維持等，因此其健康對于肝至關重要。線粒體DNA突變率高，常導致其參與編碼的線粒體蛋白錯誤折疊，但熱休克蛋白70（hot shock protein， HSP70）能夠對其再折疊實現修復，對于那些不能夠被修復的錯誤折疊蛋白會被呈遞給Lon蛋白酶（Lon protease， LonP）以及酪蛋白裂解酶（caseinolytic protease， Clp）XP復合物（ClpX和ClpP）等進行降解，筆者稱這一系列的活動為線粒體蛋白質控（mitochondrial protein quality control， MPQC）[1-4]。之前有報道，當脾氣虛時肝細胞線粒體功能損傷[5-6]，但是否與MPQC有關還不清楚。本文主要圍繞肝細胞線粒體結構和功能及MPQC等，初步探討肝耐受脾氣虛的可能機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 研究起止時間2018年9月-2019年12月，選取16只SPF級SD雄性大鼠，體重190～210 g，鼠齡7周左右，購買于遼寧省本溪市的實驗動物中心[許可證號：SCXK（遼）-2010-0001]，購進后在遼寧中醫藥大學的實驗動物中心飼養[許可證號：SYXK（遼）-2013-000-9]。飼養條件：溫度18～23 ℃，濕度45%～55%，自由進食，自由飲水。適應性飼養1周后進行實驗。

1.2 主要儀器設備 酶標儀（America Bio-Rad）;日本電子透射電鏡（JEM-1011）;轉膜儀（美國Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo Transfer Systerm）;冷凍高速離心機（美國，Thermo Sientific，ST-16R）;電泳儀（美國Bio-Rad公司，042BR14173）;顯影儀（上海天能科技有限公司，Tanon5200）。

1.3 主要試劑盒和抗體 ATP含量測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：201806）;JC-1膜電位（mitochondrial membrane potential， MMP）檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8650）;總蛋白提取試劑盒（北京TransGen Biotech有限公司，批號：K21128）;BCA法蛋白含量測定試劑盒（北京TransGen Biotech有限公司，批號：K20316）;HSP70抗體（美國Proteintech公司，批號：00055287）;LonP多克隆抗體（美國Proteintech公司，批號：00022581）;ClpP多克隆抗體（美國Proteintech公司，批號：00023008）;ClpX多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：0001812Day77812）;Beta Actin Antibody（美國Proteintech公司，批號：66009-1-lg）;山羊抗兔二抗（北京TransGen Biotech有限公司，批號：M10327）;兔抗及鼠二抗（美國Proteintech，批號：20000002）;ECL化學發光試劑盒（北京TransGen Biotech有限公司，批號：M20926）。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物的分組、模型的復制和評價 16只SD雄性大鼠根據隨機數字表法平均分成兩組，即8只正常組（對照組）和8只脾氣虛組（模型組）。模型組的大鼠按照文獻[7]方法復制脾氣虛證模型后對其進行評價，即15 d內進行5個循環的饑餓失常刺激（飽食1 d+禁食不禁水2 d）和每天力竭游泳，當出現少食、神疲、乏力和毛色枯槁時為造模成功。此實驗的項目已經通過了遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會的審核（審核批準號：20151205）。

1.4.2 肝細胞線粒體的形態學觀察 按文獻[8-9]，冰上取部分肝臟組織，冰上切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定后，按文獻[10]方法對標本進行處理，透射電鏡觀察線粒體形態并拍照。

1.4 3 肝組織ATP和肝細胞MMP水平的檢測 完成1.4.2后，按文獻[8-9]，冰上取部分肝組織，采用比色法檢測肝組織中ATP水平，JC-1法檢測MMP，均嚴格按照說明書操作。

1.4.4 肝細胞MPQC相關蛋白表達 采用Western bloting（Wb）法。按1.4.2取部分肝組織，依照前期報道方法進行檢測[8，11]，簡要如下：200 mg肝組織加入500 μL裂解液后冰上充分研磨，靜置10 min震蕩1次，共震蕩3次（靜置30 min），4 ℃ 14 000 r/min離心10 min后取上清;BCA法測每個樣本的蛋白濃度后，每管取上清50 μL加入等體積的2×SDS-PAGE，沸水浴中5 min，上樣電泳，在分子量45處切膠、轉膜（半干轉）（25 V、30 min、1 A），5% BSA/TBST中37 ℃水浴封閉2 h;分別加入HSP70（1︰2 000）、LonP（1︰1 000）、ClpX（1︰800）、ClpP（1︰1 000）和Actin（1︰5 000），4 ℃搖床過夜;TBST溶液洗膜10 min×3次，除Actin外加入由HRP標記的山羊抗鼠二抗（1︰10 000）10 mL，其他加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1︰

5 000）20 mL，用TBST溶液洗膜后在膜上滴加發光液，曝光拍照后用Alpha View SA軟件對數據進行處理。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞線粒體的形態學變化 兩組線粒體大量分布于細胞核附近，形態相似，均呈卵圓形，邊緣清楚，內部致密，未見到明顯異常變化，見圖1。

2.2 兩組肝組織ATP水平和肝細胞MMP水平比較 與正常組相比，模型組ATP和MMP水平均下降，差異均有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.3 兩組肝細胞MPQC相關蛋白表達 正常組HSP70表達為（0.599±0.048），低于模型組的（0.966±0.035），差異有統計學意義（P<0.01）;正常組LonP表達為（1.020±0.087），高于模型組的（0.730±0.080），差異有統計學意義（P<0.01）;正常組ClpX表達為（0.836±0.090），低于模型組的（1.147±0.113），差異有統計學意義（P<0.01）;正常組ClpP表達為（0.940±0.024），低于模型組的（1.288±0.120），差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2。

3 討論

脾運化水谷精微，以奉生身，而脾氣虛則五臟不安。脾氣虛對肝藏血、主疏泄的研究較多，而肝藏血與肝主疏泄相互依存，其現代醫學基礎離不開肝細胞的物質代謝和生物合成等作用[12-17]。因為線粒體不僅為肝細胞提供能量，還廣泛參與肝細胞的上述活動，所以本研究觀察了脾氣虛時肝細胞線粒體形態和功能的變化。研究結果顯示，兩組線粒體在結構上沒有明顯變化，但模型組的ATP和MMP水平均明顯降低，表明脾氣虛時肝細胞的線粒體功能受損，但還未發生器質性病變。

ATP和MMP是線粒體氧化磷酸化反應的產物及先決條件，其水平異常與呼吸鏈功能紊亂有關。線粒體呼吸鏈位于線粒體嵴上，包括5種復合體，其中4種由細胞核及線粒體中的DNA進行雙重的編碼，但線粒體DNA極易發生突變，經常會導致相關蛋白結構異常，但受控于MPQC、線粒體動力學和線粒體自噬等機制，線粒體功能損傷通常不會過于嚴重。

研究發現，脾氣虛大鼠肝細胞線粒體損傷與線粒體自噬紊亂有關[18]，但是否關聯MPQC還不清楚。MPQC的主要作用是維持線粒體蛋白穩態，簡單分為兩方面作用：一是修復異常蛋白，主要由HSP70等重新折疊而恢復其正常結構;二是降解損傷蛋白，即通過LonP和ClpXP復合物等降解難以修復的異常蛋白[19-20]。

本研究觀察到模型組的HSP70表達高于正常組，表明肝細胞修復異常線粒體蛋白的能力升高，錯配蛋白可被及時修復;模型組LonP表達降低，ClpXP復合物表達增加，提示難以修復的異常蛋白可能不多，僅上調ClpXP復合物就能夠清除。結合上述結果，可以推測脾氣虛發生后肝細胞線粒體內的異常蛋白主要是被大量修復，而難以修復的也可以被降解進而清除，這個可能就是脾氣虛組大鼠線粒體內部并沒有見到明顯損傷的原因。

上述結果提示，脾氣虛時肝細胞線粒體功能出現了一定損傷，但同時肝細胞的MPQC作用增強，從而對抗脾氣虛所造成的干擾。因此，本研究認為肝耐受脾氣虛的機制與肝細胞MPQC增強有關。

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（收稿日期：2020-11-10） （本文編輯：姬思雨）