電針深刺對三叉神經痛大鼠ERK蛋白表達及Kv3.4、Kv4.3基因表達的影響

何明偉，龐金磊，王成彬，劉亞光，吳憲宏，孫海燕

三叉神經痛(trigeminal neuralgia，TN)是一種反復發作于面部三叉神經分布區的陣發性劇烈疼痛性疾病[1-2]。TN發作次數頻繁、劇烈疼痛嚴重影響患者身心健康。卡馬西平、苯妥英鈉等藥物長期使用療效下降，且不良反應增加[3]；外科手術，如顯微血管減壓術和射頻微控熱凝術，部分患者可能出現同側小腦共濟失調和面部麻木等并發癥。大量臨床研究報道[4-6]，電針在緩解TN患者疼痛程度、減少TN發作次數上具有顯著療效，且其安全性高，但其作用機制不明。細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、鉀離子通道被證實參與了TN的發生[7]。ERK可將細胞外刺激傳到細胞內并引發轉錄、翻譯、蛋白質合成等一系列反應，最終影響中樞神經元致敏性和神經突觸的可塑性，ERK是神經性疼痛產生、痛覺信號傳遞等過程中的關鍵性因子。邢勇盛等[8]發現，電針深刺可調節TN大鼠ERK信號通路。此外，三叉神經節中鉀離子通道和受體的異常表達和堆積可能參與三叉神經痛的發生，其中電壓門控性鉀通道家族Kv3.4、Kv4.3開放可誘導瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，IA)，而IA是與面部疼痛形成最具關聯性的電流[9]。李崖雪等[10]發現電針深刺可影響TN大鼠神經節Kv3.4表達。

基于TN發病機制的復雜性及電針深刺對TN治療機制尚不明確，本研究擬建立大鼠TN模型，深入觀察電針深刺對TN大鼠痛閾的影響，綜合分析電針對ERK信號通路、電壓門控性鉀通道相關因子的影響，以期探索TN的發病機制及電針治療TN的機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：雄性SD大鼠48只[購自德清奧麗芙生物科技有限公司，許可證號SYXK(浙)2018-0019]，2月齡，體質量253～262 g。實驗前3 d適應實驗環境飼養，光照(7:00—19:00)、黑暗(19:00—7:00)，溫度22～25℃，濕度50%～55%，大鼠自由獲取水和飼料。(2)試劑與藥物：2%戊巴比妥鈉、10%水合氯醛、PBS緩沖液、4%多聚甲醛緩沖液、山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG(武漢菲恩生物科技有限公司)、兔抗ERK1/2(UPstate，美國)、invitrogen Trizol試劑盒(AMEKO，中國) 、引物(Genecopoeia，美國)。(3)儀器：顯微鏡(Olympus，日本)、鉻腸線(5-0，山東海迪科生物技術有限公司)、BME-403型細絲法檢測儀(中國醫學科學院生物醫學研究所)、激光共聚焦掃描顯微鏡(Leica，德國)、熒光顯微鏡(尼康，日本)。

1.2 實驗方法 2019年1月—2020年1月在首都醫科大學實驗中心進行實驗。雄性SD大鼠48只按簡單隨機數字表法分成3組(n=16)：假手術組、模型組、電針組。適應性飼養3 d后，右側面部去毛，消毒，腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，固定頭部及四肢，顯微鏡下以右側眉弓上方做切口，露出額骨、眼眶和鼻骨，拔離眶內結構暴露眶下神經，分離神經后，模型組、電針組使用2根鉻腸線結扎(線距1.8 mm)，鏡下檢查可見眶下神經直徑變細但保持神經外膜血液通暢；假手術組僅切開皮膚暴露神經，不做神經結扎后逐層縫合。在大鼠手術清醒后繼續飼養14 d，取無菌刺激物刺激大鼠右側顏面，若大鼠出現躲避刺激或蜷縮身體、快速抓嚙的攻擊行為及非對稱性面部搔抓3次及以上者，則為造模成功。電針組在模型成立后右側下關穴(深5 mm)、百會穴(深3 mm)刺入不銹鋼毫針。電針治療儀參數：80 Hz/s連續波、20 min，間隔6 h，每天2次，連續深刺14 d。

1.3 觀察指標與方法 所有大鼠在造模后28 d均腹腔注射10%水合氯醛(8 ml/kg)處死，快速暴露心臟并經左心室插管至主動脈，0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗并在右心耳做切口，至液體無混濁后左心室灌注4%多聚甲醛緩沖液500 ml，30 min，緩沖液固定2 h后，放置于30%蔗糖PBS緩沖液過夜，取三叉神經節做切片，待測。

1.3.1 痛閾測定： 造模前1d，造模后7 d、14 d，治療后7 d、14 d均進行大鼠患側面部痛閾監測。BME-403型細絲法檢測儀從低到高逐漸增加折力(折力：0.13 g、0.20 g、0.33 g、0.60 g、1.30 g、3.60 g、5.00 g、7.30 g、9.90 g、20.10 g)，每階段折力細絲刺激6次、每次2 s、間隔60 s，大鼠出現疼痛刺激(即躲避、攻擊或面部搔抓)的最小值即為痛閾(若20.10 g仍未出現疼痛刺激，則閾值定為20.10 g)。

1.3.2 ERK蛋白表達測定：取切片，加羊抗磷酸化ERK(p-ERK)，孵育過夜(4℃)，加標記山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG，避光反應40 min(37℃)，加兔抗ERK1/2緩沖甘油封片，陰性對照組以PBS緩沖液代替羊抗p-ERK，余操作同上，封片后激光共聚焦掃描顯微鏡拍照，采用Image J分析免疫組化圖片，強度值越高表示抗原物質量越多。

1.3.3 Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達測定：采用實時熒光定量PCR(qPCR)法測定。制膠與凝膠電泳，0.4 g瓊脂粉加入40 mlTEA溶液中并加熱溶解至透明，冷卻后加入3 μL Gelstain，導入制膠板中，凝固后行電泳，電壓110V、電流80A、時間45 min。取切片，提取總RNA，按照invitrogen Trizol試劑盒說明書操作，測定RNA濃度、純度，逆轉錄cDNA，并保存于-20℃下待測；加引物(引物序列見表1)，qPCR反應體系條件：95℃預變性5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，30個循環，后延伸(72℃ 7 min)；以β-actin為內參，在熒光顯微鏡下采用相對定量法獲取 Kv3.4、Kv4.3 mRNA△CT值。

表1 qPCR所用引物序列

2 結 果

2.1 3組大鼠痛閾值變化情況比較 假手術組各時點痛閾值比較差異無統計學意義(P>0.05)；模型組、電針組大鼠造模后7 d痛閾值均顯著高于造模前1 d(P<0.05)，造模后14 d痛閾值顯著下降(P<0.05)；電針組治療后7 d和14 d痛閾值上升(P<0.05)，且電針組治療后7 d和14 d痛閾值均顯著高于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠痛閾值變化情況比較

2.2 3組大鼠治療后14 d p-ERK、ERK免疫熒光強度值比較 模型組大鼠治療后14 d p-ERK、ERK免疫熒光強度值顯著高于假手術組(P<0.01)；電針組p-ERK、ERK免疫熒光強度值均顯著低于模型組(P<0.05)，見圖1、2。

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

圖2 3組大鼠治療后14 d p-ERK熒光染色圖(×400)

2.3 3組大鼠治療后14 d Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達比較 模型組大鼠治療后14 d Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達水平顯著低于假手術組(P<0.05)；電針組Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達水平均顯著高于模型組(P<0.05)，見圖3、4 。

圖3 3組大鼠治療后14d Kv3.4、Kv4.3mRNA電泳圖

注：與假手術組比較，aP<0.01;與模型組比較，bP<0.05

3 討 論

三叉神經痛是常見神經病理性疼痛之一，其發病機制不明，因此治療上以對癥治療或神經毀損治療為主。多數學者認為三叉神經感覺纖維脫髓鞘病變是TN的病理生理機制，并提出TN病因的兩大主流學說：中樞病因和周圍病因。前者認為TN為三叉神經脊束核內癲癇樣改變，后者認為三叉神經周圍支節段性脫髓鞘改變，但均不能解釋臨床所有案例，對于TN的病理機制仍需要不斷研究[11-13]。本研究發現，TN大鼠三叉神經節中p-ERK蛋白表達增多，同時Kv 3.4、Kv 4.3 mRNA表達減少，提示TN的發病機制可能與二者相關。電針治療后，在疼痛減輕的同時二者的表達相應產生變化，提示電針治療作用亦與二者密切相關。

大鼠眶下神經慢性縮窄環術是建立TN動物模型最常用的方式之一，可用于觀察大鼠不同時間的行為，且可反映三叉神經受壓迫后遲鈍反應期、超敏反應期及恢復期三叉神經節束核、髓鞘及丘腦、感覺皮質變化情況。本研究顯示，接受結扎神經術的模型組、電針組在造模后7 d的痛閾值呈增高趨勢，為神經結扎阻礙了神經信號傳入從而出現的短暫遲鈍反應，至造模后14 d電針組、模型組均處于超敏反應期，提示模型組、電針組TN造模成功。模型組此后至治療后14 d均處于低痛閾值，但電針組在接受電針深刺治療7 d和14 d后痛閾值提高，且在治療后14 d痛閾值與假手術組相當，提示電針深刺具有鎮痛效果。進一步研究顯示，模型組造模后28 d p-ERK、ERK免疫熒光強度值顯著高于電針組、假手術組，而Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達水平顯著低于電針組、假手術組，即模型組p-ERK、ERK大量激活、IA被抑制，電針深刺則可抑制ERK、促進IA釋放。

痛覺形成機制中，外周信號傳導是第一步，該過程包括刺激促進細胞介質釋放間接激活傳入神經末梢和刺激直接調控感覺神經末梢離子通道[14-17]。ERK直接/間接參與了刺激傳入神經末梢中的細胞介質釋放過程[7,18]。ERK是一種多功能激酶，可磷酸化多種關鍵底物改變神經元可塑性，而在神經元可塑性發生改變后，使正常生理條件下終止于脊髓后角深層的Aβ纖維向著背角淺層生芽并與次級神經元建立突觸聯系。末梢神經離子通道的改變直接引發痛覺異常。當Kv3.4、Kv4.3表達抑制時，它們介導的IA作用減弱，導致神經元興奮閾電位下降，且動作電位頻率增加、間隔縮短，導致三叉神經興奮性增加，從而導致痛覺敏化。下關穴靠近三叉神經節半月節，配穴百會為調節大腦功能的要穴，既往研究證實[5,19]，電針深刺不僅可選擇性地阻斷Aβ纖維傳遞信息，且可調節神經突觸結構可塑性。結合以上分析，電針深刺可能通過抑制ERK表達，促進Kv3.4、Kv4.3表達而上調IA水平達到臨床治療效果。

本研究嘗試分析電針深刺是通過何種/幾種信號通路影響TN疼痛，但也存在以下不足：首先，受限于研究該病作用機制標本的特殊性，多為尸檢或動物模型，與臨床案例仍有一定差距；其次，本研究中采用結扎法模擬TN，雖然操作簡單、行為易觀察，但結扎松緊度與神經纖維變性程度密切相關，在實際操作過程中不易掌握松緊度，且其為模擬周圍神經損傷模型，而眶下神經結扎也不能獲得完全符合臨床表現的理想動物模型；最后，本研究也未建立ERK抑制組、Kv4.3類似物組進行更為嚴謹的對比研究。因此，對于電針深刺如何影響TN仍有待于后續更為嚴謹的研究。

綜上所述，電針深刺可抑制大鼠三叉神經節中p-ERK、ERK水平，上調Kv3.4、Kv4.3 mRNA表達，從而達到治療TN的效果。但電針組p-ERK、ERK免疫熒光強度值及Kv3.4、Kv4.3 mRNA灰度值仍低于假手術組，這提示TN是多種信號通路共同作用的結果，且電針深刺作用的信號通路包括但不僅限于ERK信號通路、鉀離子通道，需要在今后的實驗中加以研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

何明偉：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;龐金磊、王成彬：實施研究過程，資料搜集整理;劉亞光：實施研究過程，數據統計分析;吳憲宏、孫海燕：設計研究思路，分析試驗數據，論文審核