蛋白激酶C在變應性鼻炎發病機制中的研究進展

呂浩，周方偉綜述 許昱審校

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特應性個體接觸致敏原后由免疫球蛋E(IgE) 介導的炎性因子釋放、多種免疫活性細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞等)共同參與的鼻黏膜變態反應性疾病[1]。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是由一類依賴Ca2+和磷脂激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。PKC催化的磷酸化對細胞多種生理活動必不可少，如增殖、分化等，是重要的細胞內信號轉導分子[2]。PKC及其同工酶家族表達于各種免疫細胞中，如調節性T細胞(Treg)、2型輔助T細胞(Th2)、B淋巴細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞等，參與調節固有免疫和獲得性免疫的關鍵信號轉導途徑[3]。前期研究表明，AR患者外周血淋巴細胞中PKC的活性增高，并且與外周血中IL-4、IL-5水平呈正相關[4]。不同PKC亞型參與不同的信號通路，并且具有一定的細胞特異性。然而目前對于PKC的各種同工酶亞型在變應性鼻炎中的具體機制仍不清楚。筆者從AR的免疫學機制出發，綜述PKC各家族成員在輔助性T細胞1/輔助性T細胞2(Th1/Th2)、調節性T細胞/輔助性T細胞17(Treg/Th17)、B淋巴細胞、Ⅱ型固有淋巴細胞 (ILC2s)、肥大細胞、嗜堿性粒細胞及嗜酸性粒細胞中的作用，以期為AR提供新的治療思路。

1 PKC的結構及分類

根據PKC激活方式的不同及調控結構域之間的差異，將目前已知的10種PKC家族成員分為3類：經典蛋白激酶C(PKCα、PKCβ1、PKCβ2、PKCγ)，新型蛋白激酶C(PKCδ、PKCε、PKCη、PKCθ)，非典型蛋白激酶C(PKCζ、PKCλ/ι)[5]。所有PKC同工酶具有共同的一般結構，由2個主要結構域組成，包括高度保守的催化結構域(由三磷酸腺苷/底物COOH-末端結合域和催化所需序列組成)和將酶維持在非活性構象的調節結構域(位于蛋白質的NH2-末端，包含1個自抑制性假底物結構域和2個離散的膜靶向序列)[5]。調節區和催化區通過鉸鏈區(該部位對蛋白酶極其敏感)連接一起。根據分子結構，經典蛋白激酶C由5個可變區 (V區) 和4個保守區 (C區) 組成。C1是二酰甘油 (DAG) 或佛波酯(PMA)的結合位點，C2區含有酸性脂質的識別位點，并且負責結合Ca2+，C1和C2合稱PKC的調節區；C3有1個ATP結合基序，為PKC提供能量和磷酸基團，C4是底物結合區，催化中心位于此區，C3和C4區合稱為PKC的催化區;該組的活性取決于Ca2+、DAG和磷脂酰絲氨酸 (PS)[6]。新型蛋白激酶C在結構上與經典蛋白激酶C類似， 但其C2區不具有與Ca2+結合的酸性氨基酸殘基;因此，它不依賴于Ca2+，而是需要DAG和PS來激活。非典型蛋白激酶C與前2組結構不同，C1區含有能夠與神經酰胺或PIP3結合的非經典C1結構域，且缺少C2區。因此它們不能被上述第二信使激活。aPKC的PB1 (phox and bem 1)結構域能夠與同樣有PB1結構域的支架蛋白(包括P62、PAR-6和NBR1)結合，從而調控蛋白質的空間構象和激酶活性[7]。

2 AR發病機制

目前研究表明，AR的發病機制主要表現為Th1/Th2/Th17和Treg的免疫失衡。一般認為，AR的發病過程始于接觸變應原。當變應原侵入鼻黏膜上皮后，由抗原提呈細胞(APC)攝取，被加工成小肽并與特定的主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類分子結合，形成抗原肽—MHCⅡ類分子復合物，并表達在細胞膜表面，被CD4+初始 T細胞表面的受體和其他共刺激分子識別后，使幼稚T細胞分化為Th2細胞，并產生IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子。抗原特異性Th2細胞直接刺激B細胞，誘導其分化為漿細胞并產生抗體[8]。而IL-4可以誘導B細胞IgM抗體發生類別轉換，促進IgE形成[9]。IgE與肥大細胞、嗜堿性粒細胞和APC表面的IgE高親和力受體結合，使這些細胞對變應原致敏。當機體再次暴露于變應原，IgE-FcεRI復合物在APC上的交聯有助于APC加速攝取變應原并進行加工和呈遞。同樣，這也引起肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放多種炎性介質從而在AR的發病中起作用[10]。同時，受損的鼻黏膜上皮分泌胸腺間質淋巴生成素(TSLP)、IL-33、IL-25等上皮源性細胞因子，激活Ⅱ型固有淋巴細胞釋放Th2細胞因子,促進AR的進展。Th17細胞可通過促炎因子募集嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等促進炎性細胞向鼻黏膜局部募集，從而促使發生變應性炎性反應[10]。Treg細胞作為免疫調節細胞，通過釋放細胞因子和細胞間接觸等多種機制，直接抑制變應原特異性Th2細胞的活化[11]。

3 PKC在AR相關免疫細胞中的作用

3.1 PKC在Th2細胞中的作用 Th2反應是AR發病機制的核心。PKC家族成員在T細胞中的作用已被廣泛研究，其中PKCθ的作用尤為突出。APC細胞表面的抗原肽—MHCⅡ類分子復合物與初始T細胞上的T細胞抗原受體(TCR)及共刺激分子CD28相互作用形成免疫突觸，PKCθ被特異性募集到免疫突觸中，隨后刺激T細胞中轉錄因子NF-κB、AP-1、NFAT，從而引發T細胞活化、增殖、分化等一系列免疫反應[12]。此后，越來越多的研究發現PKCθ在T細胞亞群的作用。PKCθ可正向調控Th2和Th17細胞數量及功能，而對Th1細胞、細胞毒性T細胞則無明顯影響。 有學者發現在OVA致敏的過敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ基因缺陷小鼠的血清及肺泡灌洗液中OVA特異性IgE水平明顯降低，體外培養PKCθ缺陷型T細胞則無法產生IL-4[13]。 后續研究進一步解釋了PKCθ缺陷型T細胞IL-4產生障礙的原因， PKCθ可激活CD4+T細胞NF-κB，進而促進IL-6的分泌，這誘導了CD4+T細胞IL-4的自分泌[14]。而IL-4正是誘導CD4+T細胞向Th2細胞分化及維持Th2細胞分化的關鍵細胞因子[15]。另一項研究揭示了PKCθ正向調控Th2細胞分化的新機制。在PKCθ基因缺陷的Th2細胞中發現GATA結合蛋白3(GATA3)表達水平明顯下降，而GATA3蛋白是Th2細胞特征性轉錄因子[16]。這說明PKCθ也可以通過上調GATA3表達，促進Th2細胞的分化。

除PKCθ外，aPKC在變應性疾病中也起著非常重要的作用。在條件性PKCλ/ι基因缺陷小鼠(僅在活化的T細胞中PKCλ/ι缺失)中，外周血Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)明顯降低，同時也觀察到OVA特異性IgE血清水平顯著降低[17]。而在對另一種aPKC(PKCζ)的研究中，也發現了類似的結果。在OVA誘導的過敏性哮喘小鼠模型中，PKCζ基因缺陷小鼠的支氣管肺泡灌洗液中Th2型細胞因子顯著減少；體外實驗證實PKCζ是激活JAK1/STAT6信號通路所必需的因子，該信號通路控制Th2效應子功能和IL-4受體信號傳導[18-19]。

PKC不僅在誘導分化Th2細胞階段發揮作用，而且分化成熟的Th2細胞生理活動也依賴PKC。最近一項研究表明，電壓門控鈣通道Cav1.2是人高度分化的Th2細胞中Ca2+響應和細胞因子產生的關鍵調節通道，而PKCα/β是Cav1.2鈣通道下游信號通路的重要信號轉導分子[20]。在OVA致敏的過敏性哮喘小鼠模型中，運用PKCα/β抑制劑G6976可降低Ca2+促發的Th2細胞活化和細胞因子產生[21]。

3.2 PKC在Th17/Treg細胞中的作用 Th17細胞主要分泌促炎因子IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等，通過調節Th2型細胞因子IL-5參與AR的發生和發展。Wachowicz等[22]發現PKCθ可促進nave T細胞向Th17細胞分化，體外實驗表明 PKCθ可以激活STAT3、Th17特征性轉錄因子維甲酸相關孤核受體γt(RORγt)及IL-17A/F基因組轉錄；在Th17細胞分化完成后，PKCθ通過抑制STAT4基因啟動子來穩定Th17細胞表型。Sen等[23]的研究進一步揭示了PKCθ激活轉錄因子RORγt的分子機制。Th17細胞在分化初始時共表達轉錄因子RORγt和Foxp3，Foxp3直接綁定到RORγt蛋白拮抗其結合DNA，類固醇受體共激活劑(SRC1)結合RORγt可促進Foxp3從RORγt釋放，隨后通過泛素—蛋白酶體途徑降解，從而逆轉了Foxp3介導的RORγt抑制作用。而PKCθ催化SRC1 磷酸化，是促進SRC1 結合RORγt的關鍵步驟。此外，另有研究表明，在屋塵螨(HDM)誘導的過敏性氣道炎性反應模型中， PKCλ/ι基因缺陷型小鼠較對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中的浸潤嗜酸性粒細胞數量及Th17細胞因子(包括IL-17、IL-21和IL-22)水平明顯降低[24]。后續體外實驗證實，PKCλ/ι亦是通過上調STAT3和RORγt蛋白表達，從而促進Th17細胞的活化。Treg細胞對于維持免疫穩態和自身耐受性具有重要作用，AR患者中Treg細胞數目及比例明顯降低。有研究表明，在PKCθ基因敲除小鼠的淋巴器官中，CD25+CD4+Foxp3+T細胞的百分比降低[25]。體外實驗證實，PKCθ可以通過calcineurin/NFAT通路上調轉錄因子Foxp3表達，從而促進Treg細胞的發育[26]。

3.3 PKC在Ⅱ型固有淋巴細胞中的作用 Ⅱ型固有淋巴細胞 (ILC2s)是一種新型固有免疫細胞，因分泌Th2型細胞因子而得名，主要分布于呼吸道、消化道等黏膜組織中，參與調節組織損傷、寄生蟲、變應原等刺激后的機體反應[27-28]。目前研究表明，PKCθ信號通路與ILC2s激活密切相關。Madouri等[29]發現在過敏性哮喘小鼠模型中，PKCθ對于ILC2s的激活和促進Th2型反應是必需的；敲除PKCθ基因后，小鼠肺組織中ILC2s總數量顯著降低，同時分泌IL-5、IL-13的ILC2s比例也明顯減少。體外實驗表明，PKCθ基因缺陷型小鼠中ILC2s數量降低與IRF4、NFAT1表達減少有關。而轉錄因子IRF4與NFAT1協同作用可促進T細胞IL-4基因的表達及Th2細胞反應。胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)是最主要的ILC2s激活因子之一，激活后的ILC2s釋放大量Th2型細胞因子[30]。Nomura等[31]發現在人鼻成纖維細胞中，PKCδ抑制劑可抑制TSLP的產生。

3.4 PKC在B細胞中的作用 AR患者的特征之一在于外周血中記憶性B細胞或漿細胞分化增加[32]。與PKCθ在T細胞中發揮主要作用類似，PKCβ被認為是B細胞中起關鍵作用的PKC同工酶。研究發現，在PKCβ基因敲除小鼠中，外周血B細胞活化、增殖、抗體產生方面存在明顯缺陷[33]。隨后研究表明，抗原與初始B細胞抗原受體(BCR)結合，導致受體相關酪氨酸激酶(Src家族、Syk和Btk)激活，這誘導了第二信使DAG和三磷酸肌醇的產生。受DAG刺激，PKCβ轉位到BCR信號體中，激活關鍵轉錄因子Myc、NF-κB等，最終促進B細胞活化、增殖。B細胞向漿細胞分化的啟動受轉錄因子PAX5和IRF4的雙重調控[34]。最近一項研究發現PKCβ可以上調轉錄因子PAX5和IRF4表達，從而促進生發中心的形成和漿細胞分化[35]。綜上所述，PKCβ是B細胞免疫反應的正向調節因子。因此，靶向抑制抗原特異性B細胞中PKCβ，或許是治療AR有效的策略。

3.5 PKC在肥大細胞、嗜堿性粒細胞及嗜酸性粒細胞中的作用 肥大細胞、嗜堿性粒細胞及嗜酸性粒細胞是AR中關鍵的效應細胞。Ca2+動員在肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒階段起關鍵作用，而PKCδ是FcεRI信號通路中Ca2+動員下游的重要信號轉導分子[36-37]。在過敏性哮喘小鼠模型中，腹腔注射PKCδ特異性抑制劑rottlerin可降低支氣管肺泡灌洗液中組胺濃度。另有研究表明，PKCδ可以通過非Ca2+依賴途徑參與嗜堿性粒細胞的脫顆粒作用，在大鼠嗜堿性粒細胞系RBL-2H3中發現，PKCδ促進膜融合因子Munc18a在Ser313處的磷酸化，從而導致嗜堿性粒細胞脫顆粒[38]。運用PKCδ抑制劑Ro-03-0432以濃度依賴性方式抑制嗜堿性粒細胞系RBL-2H3組胺濃度。而組胺是過敏反應，特別是速發相反應中的主要炎性介質之一。其作用主要是通過靶細胞(如血管內皮細胞、平滑肌細胞、腺上皮細胞)表面組胺H1受體來介導[39]。花粉癥患者鼻癥狀評分(VAS)與鼻黏膜中組胺H1受體(H1R)mRNA水平之間存在顯著相關性[40]。Islam等[41]研究發現，PKCδ信號通路促進H1受體基因的表達。在甲苯2，4-二異氰酸酯(TDI)致敏的AR大鼠模型中，運用PKCδ抑制劑可以顯著改善AR大鼠打噴嚏、流涕等癥狀。這些研究均表明，PKCδ通過調控肥大細胞在變應性鼻炎的發病機制中起重要作用。因此PKCδ是抗過敏藥開發中一個富有前景的靶蛋白。關于PKC在嗜酸性粒細胞中的作用則知之甚少，有限的研究表明，PKCζ是唯一在嗜酸性粒細胞中發揮作用的PKC同工酶。在體外實驗中，用PKCζ特異性抑制劑處理受血小板活化因子(PAF)或補體5a(C5a)刺激的人嗜酸性粒細胞后，嗜酸性粒細胞超氧陰離子及活性氧的產生明顯下降；同時還發現PKCζ抑制劑減弱了嗜酸性粒細胞脫顆粒和黏附作用[42]。

4 小結與展望

綜上所述， PKC是一種重要的細胞內信號轉導分子，其介導AR發病的多種免疫細胞活化和功能。PKC及下游信號通路的激活參與了Th1/Th2、Th17/Treg平衡，促進嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞等效應細胞活化，從而影響AR進程。然而目前為止，對PKC在變應性疾病中的研究大多聚焦于哮喘，而AR中的相關研究仍然匱乏。深入研究PKC不同亞型在AR中的調節機制，有利于為治療AR及其他變應性疾病提供新的治療靶點。