2017～2018年蘭州市兒童急性呼吸道病毒感染譜分析

邵麗麗， 董信芳， 丁霞， 焦瓊杰， 張世梅， 倪倩

兒童急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是5歲以下兒童死亡的第二大病因，而高達90%的呼吸道感染是由病毒引起[1-2]。呼吸道病毒種類多、感染力強而且傳播速度快，常表現出一定的時間和地域分布差異。近年來，隨著各種抗病毒、抗菌藥物和疫苗的廣泛使用、新型呼吸道病毒的發現以及氣候的改變，部分地域的呼吸道病毒病原譜正在發生變化。了解并建立局部地域ARTI病毒病原譜，對于指導臨床治療具有重要意義。本研究通過對2017年10月至2018年9月就診于我院兒科門診的0～14歲急性呼吸道感染兒童鼻咽拭子進行病毒檢測，了解2017～2018年蘭州市ARTI兒童病毒感染譜構成及流行特征，為蘭州市兒童急性呼吸道感染的防控及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年10月至2018年9月蘭州大學第二醫院兒科門診收治急性呼吸道感染患兒188例，其中男108例，女80例；年齡5個月至12歲，中位數為4歲，≤1歲41例，2～3歲40例，4～5歲60例，6～14歲47例。

1.2 診斷標準 參照《臨床診療指南·呼吸病學分冊》中急性呼吸道感染的診斷標準[3]。

1.3 納入標準 (1)符合急性呼吸道感染的診斷標準；(2)年齡≤14歲；(3)病程≤3 d；(4)患兒家屬知情同意，且本研究經本院醫學倫理委員會審查通過。

1.4 排除標準 (1)有肺結核、哮喘等病史；(2)有明確細菌感染證據或病程4 d以上的呼吸道感染；(3)合并其他全身嚴重器質性疾病者。

1.5 方法 于就診當日使用專用病毒采樣管采集鼻咽拭子后加入病毒保存液2 mL內，混勻后置于-80 ℃冰箱保存。按實驗方案要求均衡采樣，避免集中采樣，每月樣本不少于13份。提取鼻咽拭子上病毒基因組DNA和總RNA，RNA逆轉錄為cDNA，將上述DNA和cDNA置于-80 ℃保存。具體步驟參考試劑盒說明書，DNA/RNA提取試劑盒(DP315，北京天根生化科技有限公司)。采用毛細管電泳法檢測流感病毒(influenza virus,IFV)A、B型、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses,RSV)A、B型、副流感病毒(parainfluenza virus,PIV) 1～4型、腺病毒(adenovirus,ADV)、人偏肺病毒(human metapneumonia virus,HMPV)、人博卡病毒(human bocavirus,HBoV)、鼻病毒/人腸道病毒(human rhinovirus/human enterovirus,HRV/HEV)和人冠狀病毒(human coronavirus,HCoV)。聚合酶鏈式反應擴增體系包括DNA/cDNA 5 μL，10*緩沖液(buffer) 2 μL，10 mmol/L單脫氧核苷三磷酸0.4 μL，10 μmol/L引物 1 μL/條，5 U/μLTaq酶0.4 μL，焦碳酸二乙酯處理H2O補至20 μL。擴增反應條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，35個循環，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共40個循環，72 ℃ 3 min。根據瓊脂糖凝膠電泳結果估計聚合酶鏈式反應產物濃度，并將產物稀釋10倍后，取1 μL與ROX-500分子量內標0.25 μL混勻，95 ℃5 min→迅速冰浴3 min，然后置于ABI3730測序儀樣本架上進行毛細管電泳檢測。毛細管電泳結果采用Genemarker軟件查看分析。

1.6 觀察指標 不同性別、不同年齡段、不同季節中呼吸道病毒的檢出率。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計數資料組間差異采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 呼吸道病毒檢出情況 188例患兒咽拭子標本中檢出病毒陽性者173例，總陽性率為92.0%。RSV最常見，64例，陽性率為34.0%；其次為IFV，58例(30.9%)；依次遞減為PIV 43例(22.9%)、ADV 36例(19.1%)、HRV/HEV 20例(10.6%)、HCoV 14例(7.4%)、HBoV 6例(3.2%)、HMPV 4例(2.1%)。

2.2 不同性別患兒病毒檢出情況 男性患兒陽性率為88.9%(96/108)，女性為96.3%(77/80)，不同性別患兒病毒檢出率比較差異無統計學意義(χ2=3.392，P=0.066)。

2.3 不同年齡段患兒病毒檢出情況 ≤1歲患兒陽性率最高，為100.0%(41/41)，依次為6～14歲患兒95.7%(45/47)，2～3歲患兒87.5%(35/40)，4～5歲患兒86.7%(52/60)，各年齡段患兒陽性率比較差異有統計學意義(P=0.030)。不同病毒類型各個年齡段陽性率比較見表1。

表1 2017～2018年蘭州市不同年齡ARTI患兒呼吸道病毒陽性率比較[n(%)]

表1結果表明，RSV和HBoV陽性率各年齡段比較差異有統計學意義(P<0.05)。RSV感染者，≤1歲患兒陽性率顯著高于4～5歲患兒(χ2=17.385，P<0.001)和6～14歲患兒(χ2=8.568，P=0.003)，但≤1歲患兒與2～3歲患兒陽性率比較差異無統計學意義，4～5歲患兒與6～14歲患兒陽性率比較差異無統計學意義。HBoV感染者，4～5歲患兒與6～14歲患兒陽性率比較差異有統計學意義(P=0.035)，其余各組比較差異無統計學意義。

2.4 不同季節病毒檢出情況 春(3～5月)、夏(6～8月)、秋(9～11月)和冬(12～2月)呼吸道病毒總陽性率分別為93.5%(43/46)、83.3%(40/48)、93.3%(42/45)和98.0%(48/49)，差異無統計學意義(P=0.075)。不同病毒類型不同季節陽性率比較見表2。

表2結果表明，PIV在冬季陽性率顯著高于其他季節，秋季最低，差異有統計學意義(P<0.05)；HRV/HEV陽性率在冬季最高，春季最低，差異有統計學意義(P<0.05)；HCoV陽性率在冬季最高，夏季最低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 不同月份病毒檢出情況 12個月份中病毒均有檢出，檢出的高峰在2017年11月至次年3月。不同的病毒隨月份變化分布各有特點，ADV在整個檢測時間段均有檢出，高峰在12月份。RSV低谷在6、7月份，其余月份陽性率普遍較高。IFV的高峰從晚秋(11月份，53.3%)一直持續到早春(3月份，43.4%)，在2018年8月和9月出現了小高峰，6月份陽性率最低(6.7%)。HRV/HEV主要在11月份至次年2月份檢出，3月份開始下降，6、7月份再次上升。PIV流行月份為12月份到次年3月份，7月份再次出現高峰。HBoV檢出較少，基本集中在9月份至次年3月份。HBoV和HMPV零星檢出，還未看出明顯月份流行趨勢。見圖1。

圖1 2017～2018年蘭州市不同月份ARTI患兒中呼吸道病毒陽性率比較

2.6 病毒混合感染情況 188例樣本中≥2種呼吸道病毒感染的有44例，陽性率為23.4%(44/188)，包括同時感染2種病毒25例，占混合感染的56.8%(25/44)，三重感染占29.5%(13/44)，四重與五重感染各3例，占混合感染的6.8%(3/44)。混合感染主要是IFV與其他病毒的共同感染，占混合感染的45.5%(20/44)，其次為RSV與其他病毒的混合感染占36.4%(16/44)。各季節均有混合感染病例檢出，冬季混合感染率最高，與春、夏季比較差異有統計學意義(P<0.05)。≤1歲組混合感染率最高，但與其他組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

ARTI是兒童時期的常見病、多發病，是造成兒童住院和死亡的主要原因之一[4-5]。由于病毒感染是ARTI最主要的病因[1-2,6]，加之病毒流行分布不僅具有季節性，并且具有地域流行特點，所以了解本地區病毒感染流行分布特點，對于提高本地區ARTI療效、避免抗菌藥物的濫用具有重要意義。

本研究顯示，2017～2018年蘭州市ARTI患兒檢出病毒總陽性率為92.02%，高于相近時期青島(55.71%)[7]、蘇州(49.1%)[8]等多個地區，可能是由于蘭州地處西北，氣候干燥，增加了兒童對呼吸道病毒的易感性。也高于2006～2009年(73.9%)[9]，究其原因，可能與研究方法不同有一定關系，但是，我們必須注意到，病程≤3 d的急性呼吸道感染主要以病毒感染為主，應該避免過早使用或無指征使用抗菌藥物。

本研究中2017～2018年蘭州市ARTI兒童急性呼吸道感染病原以RSV陽性率最高，依次遞減為IFV、PIV、ADV、HRV/HEV、HCoV、HBoV、HMPV。查閱文獻，蘭州市呼吸道感染患兒病毒感染譜2006～2009年依次為RSV、HRV、HBoV、IFV、PIV、ADV、HMPV和HcoV[9]；2011～2012年依次為RSV、HRV、ADV和HMPV[10]；2012～2015年依次為RSV、IFV、PIV和HRV[11]。可見，2007～2018年蘭州市ARTI患兒病毒感染陽性率排序雖然有波動，但是RSV、IFV、PIV、ADV和HRV是主要的感染病毒，2012年以后，IFV、PIV和ADV感染率有增加。然而，RSV多年來始終是感染率最高的病毒。

RSV感染急性期可出現喘憋及高熱，嚴重者甚至進展為呼吸衰竭，相關研究發現，嬰幼兒期呼吸道RSV感染可致成年期肺功能不可逆下降，并使成年后哮喘發病率明顯升高[12-13]。本研究中0～3歲兒童是RSV感染主要人群，一年中除了夏季(6、7月份)，其余季節普遍陽性率較高，并且RSV與其他病毒混合感染率高達36.4%，所以，應該高度重視蘭州市ARTI患兒、尤其是0～3歲兒童RSV感染的監測及治療。

本研究中，IFV、PIV、ADV、HRV/HEV和HCoV陽性率分別位于第2～6位，但各年齡組間陽性率無顯著差異，說明各年齡段兒童都可能被此5種病毒感染；PIV、HRV/HEV和HCoV在冬季陽性率顯著高于其他季節，并且差異有統計學意義，PIV感染高峰期在2月、7月和12月，HRV/HEV感染高峰期在1月和2月，HCoV感染高峰期在12月；IFV和ADV陽性率無顯著季節差異，IFV感染高峰期在2月和11月，ADV感染高峰期在12月。本研究全年檢出HBoV 6例、HMPV 4例，此2種病毒的感染率較低。有學者報道病毒陽性率隨著年齡增長呈逐漸下降的趨勢，年齡越小感染率越高[14]。本研究顯示各年齡組中≤1歲組病毒陽性率最高(100.0%)，其次為6～14歲組(95.7%)、2～3歲組(87.5%)、4～5歲組(86.7%)，6～14歲組病毒陽性率高于2～3歲組和4～5歲組。6～14歲組感染率增加的原因考慮與學齡兒童在校人員密集，交叉感染機會增多有關，故而有必要呼吁蘭州市學校加強對學生衛生常識、呼吸道疾病防控知識的普及。

混合感染是急性呼吸道感染的常見現象，可能與病毒感染后呼吸道上皮細胞受損導致對其他病毒的易感性增加有關[15]。本研究顯示，2017～2018年蘭州市ARTI患兒混合感染率為23.4%(44/188)，主要是IFV或RSV與其他病毒混合感染；各季節均有混合感染病例檢出，冬季混合感染率最高，夏季最低；≤1歲組患兒混合感染率最高。

綜上所述，2017～2018年蘭州市0～14歲ARTI患兒中：(1)病毒感染總陽性率高達92.02%，提示病程≤3 d的呼吸道感染患兒不應該常規使用抗菌藥物；(2)RSV陽性率最高，其次依次為IFV、PIV、ADV、HRV/HEV、HCoV、HBoV、HMPV，IFV和PIV近年來呈明顯的上升趨勢；(3)要高度重視蘭州市ARTI患兒、尤其是0～3歲患兒RSV感染的監測及治療；(4)RSV、IFV和ADV陽性率無顯著季節差異，而PIV、HRV/HEV和HCoV在冬季陽性率顯著高于其他季節；(5)6～14歲組患兒病毒陽性率高于學齡前兒童，需要加強學校呼吸道疾病防控知識宣教；(6)≤1歲組患兒混合感染率最高，宜密切觀察病情變化。由于本研究中患兒病例數有限，只能部分說明蘭州市ARTI患兒病毒病原譜的變化，未來應該聯合多中心進行大樣本研究，持續監測ARTI患兒呼吸道病毒病原譜的變化，可為本地區兒童呼吸道感染疾病的臨床診治和預防策略的制訂提供更加科學的參考依據。