2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定婦科洗劑抗菌效果的體外實驗

龐芹，黃宇，吳敏，覃開羽

（1.廣西中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 婦科，廣西 柳州；2.廣西中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 藥學部，廣西 柳州）

0 引言

陰道炎是婦科常見病，引起外陰瘙癢、灼痛、陰道分泌物增多，影響患者正常生活，既往報道證實致病菌是引起陰道炎的主要病因，致病菌種類繁多，陰道炎發(fā)病率逐年上升[1-3]。目前臨床有關陰道炎的外用藥物種類較多，療效不一[4]。婦科洗屬中藥外用制劑，本研究所用婦科洗是本院協(xié)定處方，近年來婦科洗劑在院外患者使用逐漸增多[5]。有關婦科洗在陰道炎患者中的應用，臨床尚未有統(tǒng)一標準[6]。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazole Chloride, TTC）被多次推薦為抗菌實驗試劑[7]，為規(guī)范婦科洗用藥，本研究采用TTC法探討其抗菌效果。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑

TTC由上海亨代勞生物科技有限公司提供，實驗菌株包括大腸桿菌（ATCC15597）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、表皮葡萄球菌（ATCC49134）糞腸球菌（ATCC51299）、奇異變形桿菌（ATCC12453）白色念珠菌（ATCC14053）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、肺炎克雷伯菌（ATCC13883）及陰溝腸桿菌（ATCC700323）。婦科洗由本院協(xié)定處方，煎藥房煎制而成，規(guī)格300mL。新西蘭兔（清潔級）由蘇州湖橋生物科技有限公司提供。AMRESCO增菌液由上海撫生生物科技有限公司提供。

1.2 菌液備制

取冷凍保存的菌株斜面培養(yǎng)物，分別放入增菌液試管中，37 ℃下孵育24h，然后在培養(yǎng)基平板上將懸液進行分離，37 ℃下再次孵育24h。然后將菌落接種在營養(yǎng)瓊脂斜面，用生理鹽水沖洗除去斜面菌苔。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基融化，冷卻后加入TTC和1.0 mg/mL瓊脂液，稀釋成1×107cfu/mL濃度，得到實驗菌液后備用。

1.3 滅菌實驗

取婦科洗5.0mL與0.5 mL菌液混勻，作用10 min，然后制成瓊脂平板，37 ℃下孵育24h后，計算菌落數(shù)和殺菌率。菌落數(shù)和殺菌率計算方法均參照《中國藥典》附錄微生物限度檢查法：取50 cfu/mL含菌液1 mL，加入滅菌平皿，培養(yǎng)72h后計數(shù)，記錄菌落顏色變化，據(jù)此作為菌落計數(shù)，然后計算殺菌率。最低抑菌濃度計算：將婦科洗按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例進行稀釋，再將稀釋后的婦科洗溶液按每2 mL婦科洗+18 mL培養(yǎng)基混勻備用。取少量待測菌株研磨，配制0.5麥氏單位菌懸液，再以1:10比例稀釋，滴種于各婦科洗培養(yǎng)基中，37 ℃孵育24h后，記錄最低抑菌濃度，以無菌生長的最高稀釋濃度作為最低抑菌濃度。最低記錄致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度。以相鄰菌落團數(shù)量明顯減少或試驗菌顏色明顯變化為致病菌開始被抑制時間，以菌落團被殺滅消失為完全被抑制。

1.4 毒性實驗

取清潔級新西蘭兔，用醫(yī)用剪刀剪去兔脊柱兩側(cè)區(qū)域兔毛，每側(cè)30 mm×30 mm，一側(cè)用沾有婦科洗的紗條浸潤貼敷，另一側(cè)作為對照。

2 結(jié)果

2.1 婦科洗殺菌效果

婦科洗藥液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌均具有較好的殺菌效果，隨著時間延長，殺菌率有上升趨勢，見表1。

表1 婦科洗殺菌效果（%）

2.2 各致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度

在加入TTC的增菌液中，各致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度，見表2。

表2 致病菌開始被抑制和完全被抑制時TTC濃度（mg/mL）

2.3 婦科洗最低抑菌濃度結(jié)果

婦科洗對陰道炎各菌種均具有一定程度的殺菌作用，其強度依次為大腸桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌及表皮葡萄球菌，見表3。

表3 婦科洗最低抑菌濃度結(jié)果（g/L）

2.4 毒性試驗結(jié)果

毒性試驗結(jié)果顯示，未出現(xiàn)紅腫、潰爛等毒副反應。

3 討論

陰道炎是臨床最常見感染性疾病。目前，隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，陰道炎療效逐漸改善[8]。中醫(yī)藥引起毒副作用少的特點受到臨床醫(yī)師和患者青睞，在陰道炎治療尤其是院外患者自行治療方面占據(jù)重要地位[9]。外用洗劑可直接作用于病變部位，發(fā)揮清洗、抗菌作用。婦科洗屬于中藥外用成劑，包含黃柏、蛇床子、地膚子、松崗油等成分，黃柏性寒，具有清熱燥濕作用[10]，藥理學研究證實其有效提取物川黃柏生物堿具有良好的抗炎殺菌作用[11]。解光艷等[12]則認為蛇床子素可通過破壞外陰念珠菌病混合菌的生物膜，進而達到滅菌效果。而地膚子對大腸桿菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌均具有抑菌作用[13]。近年來有關婦科洗在臨床應用已有報道[14]，但用藥方案不一。

本研究通過體外實驗檢測婦科洗對陰道炎常見致病菌種的抑制作用，并計算最低抑菌濃度，為臨床合理用藥提供參考。TTC即C19H15CIN4，屬無色氧化劑，分解性強，還原形成三苯甲臜，能清晰顯示菌落分布，TTC被作為指示劑廣泛用于臨床[15]。另外，本研究瓊脂濃度為1.0 mg/mL，Shinu P等[16]發(fā)現(xiàn)以此濃度可使菌落呈短線或圓球狀，并使菌液顯色，減少漏檢，這對于提高檢測計算的準確性具有重要意義。另外，也有學者認為樣品試劑中可能因含有其他菌種而影響菌落計數(shù)，造成結(jié)果不準確。TTC不僅具有顯色效果，且具有一定的抑菌作用，這也可能影響對婦科洗滅菌效果的檢測結(jié)果。其干擾作用可能隨TTC濃度增加而增大，理論上既能顯示相同殺菌抑菌效果、干擾作用又小的濃度為最佳TTC濃度，本研究設計使用了不同梯度濃度的TTC目的也在于此。此外，本研究顯示TTC對不同菌株開始被抑制和完全被抑制時間有所不同，這可能與其敏感度有關，而對于不同來源的同一菌株在TTC中是否具有敏感性差異也有待今后進一步研究。

綜上，TTC用于婦科洗的體外滅菌實驗，有助于提高菌落顯色效果，減少漏檢，但有關其與不同致病菌敏感性關系有待深入研究。