微RNA-130a靶向人類RUNT相關轉錄因子3對肺癌A549細胞增殖和轉移的影響

徐漢橋，方軍，張梁

肺癌是一個多基因共同調控的復雜事件，盡管圍繞肺癌機制的研究取得了部分進展，但臨床治療肺癌的藥物效果并不理想，因此尋找新的有效的治療靶點一直是包括肺癌在內的腫瘤研究的熱點。我們采用生物信息學軟件預測發現，微RNA（miR）-130a與人類RUNT相關轉錄因子3（RUNX3）3’非翻譯區（UTR）存在互補的核苷酸序列，猜測miR-130a可能通過靶向調控RUNX3介導非小細胞肺癌的發生發展。為了驗證上述猜測，本研究于2018年2月至2019年5月以肺癌A549細胞為研究對象，通過觀察miR-130a與RUNX3的靶向關系以及其對A549細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化的影響，旨在闡明miR-130a在肺癌發生中的作用，以期為以miR-130a為靶點的肺癌治療提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

非小細胞肺癌細胞株A549（中科院上海細胞庫），胰蛋白酶、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑和青鏈霉雙抗（美國Sigma公司）。兔抗人上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體（英國Abcam公司），辣根過氧化酶標記的二抗（北京中杉金橋生物公司），DMEM培養基、胎牛血清和Transwell小室（美國Hyclone公司），Matrigel基質膠（美國BD公司），miR-130a mimics、miR-130a inhibitor及其對照和RUNX3-siRNA及對照NC-siRNA（上海吉瑪公司）。轉染試劑脂質體2000、青鏈霉素（美國Invitrogen公司），鼠抗人RUNX3單克隆抗體和β-actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（瑞典Amersham公司），脫脂奶粉（北京鼎國生物公司），Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、逆轉錄PCR（RT-PCR）試劑盒和PCR擴增相關試劑（大連TaKaRa公司），BCA蛋白定量試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司），總蛋白提取試劑盒和ECL試劑盒（上海凱基生物公司）。二氧化碳細胞培養箱（美國Formascientific公司），熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞培養、實驗分組與轉染

以DMEM培養基（含100 mL/L胎牛血清+100 kU/L青鏈霉雙抗）于5%二氧化碳、95%相對濕度和37℃的細胞培養箱中常規培養A549細胞。將對數生長期的A549細胞以10個/孔的密度接種至6孔細胞板上，常規培養過夜。實驗分為對照組（未處理）、anti-miR-NC組（轉染miR-130 inhibitor陰性對照）、anti-miR-130a組（轉染miR-130a inhibitor）、anti-miR-130a+siNC組（轉染miR-130a inhibitor和NC-siRNA）和anti-miR-130a+siRUNX3（轉染miR-130a inhibitor和RUNX3-siRNA）。待細胞匯合度高于75%時，根據實驗分組并參照脂質體2000說明書步驟將miRNAs和siRNAs轉染至相應的A549細胞中。轉染48 h后，收集各組細胞分別用于miR-130a、RUNX3 mRNA和蛋白表達以及細胞增殖、侵襲、上皮間質轉化的檢測。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測A549細胞中miR-130a和RUNX3 mRNA的表達

以Trizol法提取A549細胞的總RNA，并將RNA逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。以cDNA為模板，配制20μLPCR反應體系（2μL cDNA、各0.8μL正反向引物、10μLSYBRPreix EXTaqⅡ、0.4μLROXReference Dye和6μL雙蒸水），設定PCR擴增條件為95℃預變性20 s、（95℃變性15 s、58℃退火30s、72℃延伸30s）循環38次，以U6和β-肌動蛋白（β-actin）作為內參基因，2法計算A549細胞中miR-130a和RUNX3mRNA的相對表達量。miR-130a引物（正向：5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3’，反向：5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3’）、U6引物（正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反 向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’）、RUNX3引物（正向：5’-CAGTGGGCGAGGGAAGAGT-3’，反向：5’-CGGGAGGTAGGTATGGTAA-3’）和β-actin引物（正向：5’-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3’，反向：5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’）是由上海吉瑪公司合成。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測A549細胞中RUNX3蛋白和上皮間質轉化相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達

參照總蛋白提取試劑盒抽提A549細胞的總蛋白，并采用BCA法檢測總蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與上樣緩沖液（2×）等體積混合煮沸5 min。參照SDSPAGE試劑盒配制SDS-PAGE凝膠，以每孔80μg行電泳分離。轉至PVDF膜后，浸泡于含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h。加入一抗（RUNX3 1∶500、E-cadherin 1∶1 000、N-cadherin 1∶1 000和Vimentin 1∶1 000）于4℃下與目的蛋白特性性結合24 h。封閉液洗膜5分鐘/次，共3次。再加入二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h。參照ECL試劑盒顯影曝光后，以β-actin為內參，凝膠成像系統掃描分析。實驗重復3次。

1.2.4 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測A549細胞存活率

將轉染后的各組A549細胞按照10個/孔的密度接種于96孔細胞板上。每個處理設5個平行孔，并設置一組不含細胞的培養基作為空白組。常規培養48 h后，給予20μLMTT試劑（5 g/L）作用細胞，4 h后以100μL二甲基亞砜溶解紫色結晶。選取檢測波長為570 nm，酶標儀測定各組細胞吸光度OD值，并計算出各組細胞的存活率。計算公式：細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。實驗重復3次。

1.2.5 平板克隆形成實驗檢測A549細胞的克隆形成能力

取12孔細胞板，將轉染后的各組A549細胞按照10個/孔的密度進行鋪板，常規培養2周左右（每隔3 d換液）。當形成肉眼可見克隆時，取出培養板棄上清液。先以磷酸緩沖液洗滌細胞后，分別采用4%多聚甲醛和0.5%結晶紫對A549細胞進行固定與染色。染色結束后，洗滌風干，置于顯微鏡下統計有效克隆數（超過50個細胞的集落），并計算各組細胞的克隆形成率。計算公式：克隆形成率（%）=（有效克隆數/接種細胞數）×100%。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell小室檢測A549細胞的侵襲和遷移能力

采用無血清培養基調整轉染后的各組A549細胞濃度，使其每毫升含有10個細胞。將以Matrigel膠包被或不包被的Transwell小室放于12孔細胞板中，下室中加入含血清的培養基500μL，上室中加入細胞液200μL。常規培養24 h后，取出小室。使用棉簽小心除去上室內的細胞，并以4%多聚甲醛固定和0.5%結晶紫對下層細胞進行固定與染色。沖洗晾干后，置于倒置顯微鏡下觀察（隨機選取5個視野）侵襲細胞數或遷移細胞數。實驗重復3次。

1.2.7 熒光素酶實驗檢測miR-130a和RUNX3的靶向關系

采用生物信息學軟件預測miR-130a與RUNX3 3’UTR存在互補的核苷酸序列，構建突變型（RUNX3-MUT）和野生型（RUNX3-WT）的RUNX3 3’UTR熒光素酶載體，參照脂質體2000行miR-NC（miR-130a mimics陰性對照）+RUNX3-WT、miR-130a（miR-130a mimics）+RUNX3-WT、miR-NC+RUNX3-MUT、miR-130a+RUNX3-MUT四組共轉染。轉染48 h后，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組細胞的熒光素酶活性。實驗重復3次。

2 結果

2.1 RUNX3是miR-130a的潛在靶基因

采用生物信息學軟件TargetScan預測結果（表1）顯示，miR-130a與RUNX3 3’UTR存在互補的結合位點。進一步采用熒光素酶實驗檢測顯示，四組差異有統計學意義（

F

=75.960，

P

＜0.001），與miR-NC+RUNX3-WT組（1.01±0.07）相比，miR-130a+RUNX3-WT組（0.42±0.04）細胞的熒光素酶活性顯著下降（

t

=12.675，

P

＜0.05），而miR-NC+RUNX3-MUT組（0.98±0.05）和miR-130a+RUNX3-MUT組（0.96±0.06）之間細胞的熒光素酶活性差異無統計學意義（

t

=0.444，

P=

0.680）。

表1 微RNA（miR）-130a與人類RUNT相關轉錄因子3（RUNX3）3’UTR的結合位點

2.2 轉染miR-130a inhibitor和RUNX3-siRNA使A549細胞中miR-130a和RUNX3表達的表達降低

與對照組相比，轉染miR-130a inhibitor可成功下調A549細胞中miR-130a的表達水平，而上調RUNX3 mRNA和蛋白的表達（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a組相比，轉染RUNX3-siRNA可使A549細胞中RUNX3 mRNA和蛋白的表達水平明顯降低（

P

＜0.05）。見圖1和表2。

表2 各組細胞中微RNA（miR）-130a以及人類RUNT相關轉錄因子3（RUNX3）mRNA和蛋白相對表達量的比較/±s

圖1 蛋白質印跡法檢測人類RUNT相關轉錄因子3（RUNX3）蛋白表達的影響

2.3 下調miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細胞增殖

與對照組相比，下調miR-130a可抑制A549細胞增殖和克隆形成能力（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，靶向干擾RUNX3的表達可逆轉miR-130a對A549細胞增殖的抑制作用（

P

＜0.05）。見表3。

表3 各組非小細胞肺癌A549細胞存活率和克隆形成率的比較/±s

2.4 下調miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細胞侵襲和遷移

與對照組相比，下調miR-130a表達可抑制A549細胞的侵襲和遷移能力（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，下調靶基因RUNX3的表達可逆轉miR-130a的上述作用（

P

＜0.05）。見圖2、表4。

表4 miR-451過表達對非小細胞肺癌A549細胞侵襲和遷移的影響/±s

圖2 Transwell小室檢測各組細胞的侵襲和遷移（0.5%結晶紫染色×200）

2.5 下調miR-130a通過靶向RUNX3抑制A549細胞上皮間質轉化

與對照組相比，下調miR-130a的表達可抑制N-cadherin和Vimentin蛋白的表達，而促進E-cadherin蛋白的表達（

P

＜0.05）；與anti-miR-130a相比，干擾RUNX3的表達可逆轉miR-130a對N-cadherin、E-cadherin和Vimentin蛋白的調控作用（

P

＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 蛋白質印跡法檢測非小細胞肺癌A549細胞中上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達

表5 各組非小細胞肺癌A549細胞中上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經型鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）相對表達量的比較/±s

3 討論

既往研究表明，微小RNA（miRNAs）可通過靶向相關靶基因調控細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程在肺癌發生及發展中扮演著癌基因和抑癌基因的角色。miR-130a是miR-130家族成員，被證實在白血病、鼻咽癌和結腸癌等腫瘤中異常表達，通過多種途徑影響腫瘤細胞增殖、轉移和耐藥等，作為致癌或抑癌因子參與腫瘤的發生發展。Chen X等在三陰性乳腺癌組織中發現miR-130a表達下調，miR-130a過表達可通過靶向調控與癌癥的侵襲和轉移有關FOSL1的表達，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。Wang等指出，miR-130a在胃癌組織中表達下降，且與病人總生存期縮短有關；上調其表達可靶向調控TBL1XR1體外抑制癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化，體內抑制成瘤和肺轉移。除了在乳腺癌和胃癌中發揮著抑癌基因的作用外，miR-130a還在部分腫瘤中異常高表達，發揮著致癌基因的作用。例如：Chen J等在骨肉瘤研究中證實miR-130a表達上調，與骨肉瘤轉移有關；并證實miR-130a可通過靶向調控PTEN在骨肉瘤細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化過程中發揮著重要的促進作用。許旭東等研究發現，miR-130a在口腔腫瘤組織中高表達，其過表達可通過抑制PJA1促進腫瘤細胞的增殖和遷移。

盡管張海濤等研究證實miR-130a在肺癌組織中高表達，與腫瘤大小、淋巴結轉移和臨床分期有關，可通過下調Smad4在肺癌細胞惡性增殖過程中發揮著促進作用，但其對細胞增殖和轉移的分子機制并不完全清楚。RUNX3是RUNT家族成員，可通過調控生長信號途徑如TGF-β等影響細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程，在結腸直腸癌、胃癌和喉癌等腫瘤的進展中發揮著重要作用。已有研究證實，RUNX3在非小細胞肺癌中低表達，而敲除其表達可顯著挽救了miR-661表達不足對肺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。

本研究通過生物信息學軟件預測到miR-130a與RUNX3 3’UTR區域存在互補的結合位點，猜測miR-130a可能通過靶向調控RUNX3的表達參與肺癌的發生發展。為了驗證上述猜測本研究采用熒光素酶實驗證實RUNX3是miR-130a的潛在靶基因。同時成功下調miR-130a表達后發現，肺癌A549細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化過程均明顯受到抑制；同時轉染RUNX3-siRNA干擾RUNX3表達后發現，RUNX3的表達下降逆轉了miR-130a低表達對A549細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化的抑制作用。該結果首次證實了RUNX3是miR-130a的靶基因，miR-130a低表達可通過靶向調控RUNX3表達抑制A549細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化。提示，miR-130a靶向調控RUNX3表達介導的細胞增殖和轉移是肺癌惡性發展的重要機制，該結果為肺癌的發生發展機制和治療提供了新線索。

綜上所述，RUNX3是miR-130a的潛在靶基因，下調miR-130a可通過靶向調控RUNX3表達抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化。