腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥circRNA-miRNA-mRNA調控網絡的構建

朱琳

腦神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發 性惡性腫瘤。目前，最大限度的手術切除，術后輔以放化療是神經膠質瘤治療的主要方法。其中替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）在腦膠質瘤，尤其是神經膠質母細胞瘤（WHOⅣ）治療上取得了成功，其明顯降低了術后復發率，大大提高了腦膠質瘤的生存率。目前替莫唑胺是臨床治療腦神經膠質瘤的一線化療藥物。但隨著用藥周期的延長，幾乎所有初始治療有效的病人都會出現病情進展，產生替莫唑胺耐藥（Temozolomide Resistance，TR）。其耐藥機制尚未完全明確。

環狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一類新型的內源性非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），其特征是3'和5'端以閉環結構共價連接，因此circRNA不易受核酸內切酶的影響，在體內表達穩定，是目前較為理想的疾病診斷生物標志物，以及分子生物治療靶點。circRNA可通過多種途徑發揮腫瘤調控作用，但目前研究較為清楚的是其微小RNA（microRNA，miRNA）海綿作用，circRNA通過miRNA海綿競爭性的與靶miRNA結合，使miRNA降解或者失去調控功能，進而調控miRNA下游靶基因的表達水平。目前研究表明，circRNA在非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤中異常表達，而且環狀RNA（circRNA）-微小RNA（miRNA）-信使RNA（mRNA）調控網絡也參與了多種腫瘤的發生、發展、放療抵抗，以及化療耐藥等過程。但目前circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調控網絡在腦神經膠質瘤替莫唑胺中研究較少。

因此，本研究以人腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥細胞株U87/TR以及其親本細胞株U87為細胞模型，通過高通量circRNA芯片比較其circRNAs表達譜差異，并初步篩選關鍵circRNAs，并預測circRNAmiRNA-mRNA調控網絡，為進一步深入研究circRNA在腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥中的作用及其分子機制提供依據。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

人腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株購買于上海弘順生物科技有限公司（規格BW124577）。RPMI-1640培養液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司。RNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司，RT-PCR試劑盒等購自美國Sigma公司。circRNA芯片的制備與雜交由上海吉凱生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 circRNA芯片檢測及數據分析

用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）提取人腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株總RNA（n=3）。使用NanoDrop ND-1000量化每個樣品的總RNA。樣品制備和微陣列雜交是根據美國Arraystar公司的標準方案進行的。總RNA用Rnase R消化以除去線性RNA并富集環狀RNA。然后，將富集的環狀RNA擴增并轉錄為熒光cRNA（Arraystar超級RNA標記試劑盒；Arraystar）。標記的cDNA（complementary DNA）探針與美國Arraystar人源性環形RNA芯片2.0版Arraystar Human circRNA Array V2（8x15K，Arraystar）雜交。使用安捷倫功能提取軟件（版本11.0.1.1）來分析獲取的陣列圖像。使用R軟件Limma軟件包執行分位數歸一化和后續數據處理。通過火山圖（Volcano Plot）過濾鑒定了兩組之間表達circRNA差異有統計學意義。通過倍數變化過濾鑒定了兩個樣品之間差異表達的circRNA。進行了層次聚類，以顯示樣品之間可區別的circRNA表達模式。

1.2.2 RT-PCR芯片結果驗證

將circRNA芯片分析結果中差異表達倍數及信號值較高的4個circRNAs行RT-PCR分析，分布為上調的circRNAs：人環 狀 RNAhsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338；和下調的circRNAs：hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975，進一步驗證芯片檢測結果的可靠性。利用軟件Primer Premier 5.0設計引物（表1）。以U87和U87/TR細胞總RNA 2μg為模板，進行逆轉錄，以GAPDH作為內參照。按照試劑盒操作進行PCR反應，條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃31 s，擴增40個循環。以2表示circRNA的表達水平，實驗重復3次。

表1 引物設計

1.2.3 生物信息學分析

運用Miranda v5數據庫（http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosiTi/htdocs/targets/v5）預測circRNA-miRNA結合關系以及結合位點。miRNA靶基因預測軟件：miRanda v5（http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosiTi/htdo/targets/v5），TargetScan（http：//www.targetscan.org）和mi-Base（http：//pictar.bio.nyu.edu）。circRNA-miRNAmRNA調控網絡通過Cytoscape軟件進行可視化（Version 3.6.1：http：//cytoscape.org/）。

1.3 統計學方法

應用SPSS 18.0進行統計學分析，兩組細胞間各circRNAs水平差異分析采用配對樣本

t

檢驗，

P

＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circRNA差異表達譜

circRNA芯片數據經過標準化處理和統計學分析，結果顯示，與親本U87細胞株相比，在U87/TR細胞株中，共鑒定出313個差異有統計學意義表達的circRNAs，其中包括145個明顯上調的circRNA和168個明顯下調的circRNA，成功建立神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關circRNA差異表達譜。層次聚類分析篩選顯示了顯著上調的下調的前10位circRNAs。表2，3列出了顯著上調和下調的前10位circRNAs詳細信息。

表2 在U87/TR細胞株中鑒定出較親本U87細胞株上調的前10位circRNAs

2.2 RT-PCR驗證芯片結果

為了進一步證實circRNA芯片的準確性，我們將circRNA芯片分析結果中差異表達倍數及信號值較高的4個關鍵circRNAs行RT-PCR分析驗證（上下調circRNAs各2個），RTPCR結果顯示，相比較于U87細胞，hsa_circRNA_009054和hsa_circRNA_104338在U87/TR細胞中顯著高表達（

n

=3，

t

=12.09、9.52，

P

=0.007、0.011），hsa_circRNA_016459和hsa_circRNA_101975在U87/TR細胞中明顯低表達（

n

=3，

t

=13.86、7.75，

P

=0.005、0.016），而且RT-qPCR結果與circRNA芯片結果相符（表4），證實了circRNA芯片的準確性。從而鑒定了hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338（上調）以 及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975（下調）4個神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關的關鍵circRNAs。

表4 RT-PCR驗證結果與circRNA芯片檢測結果對比

2.3 circRNA-miRNA調控網絡的構建

同時，我們通過miRanda v5數據庫對鑒定的關鍵circRNAs進行miRNA靶位點預測。miRNA靶位點預測結果顯示，hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338以及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975均可與多個miRNAs靶向結合，hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-33a-5p，hsamiR-4685-5p，hsa-miR-6855-5p，hsa-miR-2467-5p，hsa-miR-4446-3p；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-15b-3p，hsa-miR-550a-5p，hsa-miR-509-5p，hsa-miR-1224-3p，hsa-miR-758-5p；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分 別 為：hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-134-5p，hsamiR-4439，hsa-miR-6820-5p，hsa-miR-5190；hsa_circRNA_009054排名前五位的miRNA分別為：hsa-miR-23a-5p，hsa-miR-423-5p，hsa-miR-875-3p，hsamiR-877-3p，hsa-miR-30b-3p。通過生物信息學分析，我們進一步預測了hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338以及hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975與其排名第一位的靶向miRNA的具體結合位點（分別為：hsa-miR-33a-5p，hsamiR-15b-3p以 及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p），見圖1。從而鑒定了hsa-miR-33a-5p，hsa-miR-15b-3p以及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p 4個神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關的關鍵miRNAs，構建了神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關的circRNA-miRNA調控網絡。

圖1 關鍵circRNAs與關鍵miRNAs靶向結合位點的詳細注釋圖

表3 在U87/TR細胞株中鑒定出較親本U87細胞株下調的前10位circRNAs

2.4 circRNA-miRNA-mRNAs調控網絡的構建

進一步我們通過miRanda v5、TargetScan、miBase數據庫對關鍵miRNAs.進行靶基因預測，并通過Cytoscape軟件對circRNA-miRNA-mRNA調控網絡進行可視化分析。從而構建了神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關的circRNA-miRNA-mRNAs調控網絡，我們預測的circRNA-miRNA-mRNAs調控網絡，包括4個關鍵circRNAs，20個關鍵miRNAs，以及278個關鍵mRNAs。這些關鍵circRNAs，miRNAs，以及mRNAs通過網絡互相作用，影響神經膠質瘤替莫唑胺耐藥過程。

3 討論

腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥仍是臨床亟待解決的關鍵問題。目前研究認為，DNA損傷修復機制，如O-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（MGMT），DNA錯配修復（mismatch repair，MMR），堿基切除修復（base excision repair，BER）；腫瘤微環境；腫瘤細胞自噬；p53、EGFR、PI3K/AKT、JAK2/STAT3等信號通路等異常激活與失活、非編碼RNA調控均可能與腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥相關，但其具體機制尚未完全闡述。其中非編碼RNA調控與腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥的相關性越來越受到重視。

circRNAs表達較線性RNA穩定，而且在體內的表達量是線性RNA的10倍以上。研究表明，circRNA的異常表達與調控作用與腫瘤的發生發展密切相關，而circRNA-miRNA-mRNA調控網絡成為腫瘤研究的重要方向。在非小細胞肺癌中，有研究 表 明，hsa_circ_0087862可 通 過 靶 向miR-1253/RAB3D軸在非小細胞肺癌中發揮癌基因作用，circ_FGFR1可通過miR-381-3p促進在非小細胞肺癌細胞的進展以及PD-1耐藥。在乳腺癌中，有研究 發 現，Hsa_circ_0091074可 通 過microRNA-1297促進三陰性乳腺癌細胞的進展，circ-ABCB10可通過Let-7a-5p/DUSP7軸促進乳腺癌的紫杉醇耐藥。在胃癌中，有報道稱，circRNA_100876可通過抑制miR-136上調MIEN1的表達增強胃癌的增殖和轉移能力，circ_CCDC66可通過miR-618/BCL2軸促進胃癌的順鉑耐藥。這些研究表明circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調控網絡參與了多種腫瘤的發生發展，以及耐藥等演進過程。但目前circRNA以及circRNA-miRNA-mRNA調控網絡在腦神經膠質瘤替莫唑胺中未見相關研究。

在我們研究中，我們選取了人腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥U87/TR細胞株以及其親本U87細胞株為細胞模型，通過高通量circRNA芯片篩選其circRNAs表達譜，結果發現倆細胞株之間存在313個差異有統計學意義表達的circRNAs，其中包括145個明顯上調的circRNA和168個明顯下調的circRNA，說明腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥伴隨著circRNA的改變，為篩選關鍵circRNAs，我們選取上下調差異倍數最高的兩個circRNA進行PR-PCR驗證，其結果與芯片相符，我們通過miRNA預測，以及靶基因預測，構建了circRNA-miRNA-mRNA調控網絡，這個包括hsa_circRNA_009054，hsa_circRNA_104338 和 hsa_circRNA_016459，hsa_circRNA_101975 4個 關 鍵circRNAs，hsa-miR-33a-5p，hsamiR-15b-3p以及hsa-miR-193b-5p，hsa-miR-23a-5p等20個關鍵miRNAs，以及THOC2，TP53，STAT5B，RORC等與腫瘤發生發展密切相關278個關鍵mRNAs。這些關鍵circRNAs，miRNAs，以及mRNAs可能通過網絡互相作用，影響神經膠質瘤替莫唑胺耐藥過程。但目前的研究仍無法直接證明circRNAs對腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥的調控作用，接下來，我們課題組將向U87/TR細胞株轉染關鍵circRNA過表達和干擾質粒，建立過表達或干擾circRNA細胞模型，鑒定circRNA對U87/TR細胞株生物學行為的影響，明確circRNA下游的具體的miRNA-mRNA調控網絡及其機制。

綜上所述，我們的研究構建了替莫唑胺耐藥相關的關鍵circRNA-miRNA-mRNA調控網絡，為深入研究circRNA在腦神經膠質瘤替莫唑胺耐藥中的作用及其分子機制提供了實驗依據和前期基礎。