梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方治療冠心病室性期前收縮97例療效與網絡藥理學研究

錢偉，胡元會，郝志曄，李宛珊，關山月，龍峻標

目前已有研究證實室性期前收縮可增加冠狀動脈供血不足，并增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病猝死風險，能夠有效控制冠心病病人期前收縮既能夠延緩心肌缺血，又有助于保護心臟功能。為尋找有效治療冠心病室性期前收縮的中藥方劑，筆者總結了梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方治療冠心病室性期前收縮的臨床經驗，并對梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方藥物組成進行網絡藥理學分析，以探討該方治療冠心病室性期前收縮的臨床療效及藥理學相關作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

總結觀察2018年7月至2019年10月中國中醫科學院廣安門醫院（南區）診治的冠心病室性期前收縮病人。入選標準：“冠心病”臨床診斷符合WHO臨床診斷標準，期前收縮診斷依據24 h動態心電圖所見；病人均以“心悸”為主訴，中醫診斷符合“心悸”范疇，辯證均屬“肝郁血虛，郁熱內盛”。排出標準：（1）心臟瓣膜病、心肌病及先天性心臟病病人；（2）有嚴重心、肺、肝及腎功能不全等疾??；（3）對中藥成分有過敏史者。本研究共納入97例冠心病期前收縮病人：治療組52例，其中男性病人24例，女性病人28例；年齡最大69歲，最小33歲；對照組45例，其中男性病人21例，女性病人24例；年齡最大66歲，最小32歲；病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 治療方法

對照組：給予富馬酸比索洛爾片（北京華素制藥股份有限公司，批準文號H10970082，批次180424）2.5-5.0 mg/d。觀察組：應用梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁：炒梔子6 g，淡豆豉12 g，生丹皮10 g，白芍12 g，柴胡10 g，當歸12 g，炒白術12 g，茯苓30 g。伴胸悶、胸痛，脈弦、舌暗者加丹參15 g、砂仁6 g；伴有夜眠不佳者加炒酸棗仁30 g、夜交藤12 g；情緒波動、心煩易怒者加生龍骨30 g、生牡蠣30 g先煎；伴有頭痛、頭暈者加法半夏9 g、天麻12 g。水煎服，每日1劑，分2次早晚服藥。觀察服藥4周療效。

1.3 觀察指標及療效判定標準

觀察中醫癥狀：心悸、胸悶胸痛、心煩易怒、夜眠不佳、頭暈頭痛、目眩、耳鳴、口干口渴、舌質紅、苔薄黃、脈細弦、代脈、促脈等癥狀，對上述中醫證候進行評價，總分0～20分，分值越高表示臨床癥狀越嚴重。

冠心病室性期前收縮療效標準參考《常見疾病的診斷與療效判定》。顯效：主癥消失或基本消失，心電圖、24小時動態心電圖期前收縮次數減少90%以上。有效：主癥明顯好轉，心電圖、24小時動態心電圖期前收縮次數減少50%～89%。無效：主癥無明顯變化，心電圖、24小時動態心電圖期前收縮次數減少不足49%、無變化或期前收縮增加者。

1.5 網絡藥理學研究方法

1.5.1 方藥成分收集與篩選

梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方中共含9味中藥材，分別以9味中藥名為關鍵詞，在傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）中查找所含成分，通過口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選方中活性成分。OB值用于評價藥物能否發揮藥效，DL值用于評價藥物成分是否與已知化學藥物存在相似性，通過篩選建立藥物靶標數據庫。通過GeneCards數據庫（http：//www．genecards．org/）篩選冠心病室性期前收縮相關基因和蛋白靶標，建立數據集。將所有靶標通過UniProt數據庫轉化為識別碼格式，并對方藥有效成分靶標與疾病相關靶標取交集，尋找藥物與疾病的相關靶標。

1.5.2 “成分-靶標”交互網絡與PPI網絡的構建與分析

為進一步研究梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方中所含活性成分與冠心病室性期前收縮靶標之間的相互關系，尋找方藥與疾病靶標交集，將搜集到的有效化合物成分與靶標信息導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析。

1.5.3 GO富集分析

通過R語言Clusterprofiler包對PPI網絡中的蛋白進行基因本體（GO）富集分析，分別進行生物過程分析（BP）、細胞組成分析（CC）及分子功能分析（MF），對基因集合或基因簇進行功能聚類的統計分析，根據富集的相關梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方靶標數目及統計學差異繪制GO富集分析氣泡圖。

1.5.4 KEGG通路富集分析

通過R語言Clusterprofiler包對PPI網絡中的蛋白進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，得出交互網絡中的直接作用靶標相關通路，對結果進行功能聚類的統計分析并繪制KEGG富集分析氣泡圖。將得到的通路條目、靶點信息導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制得到靶點-通路圖。

2 結果

2.1 臨床觀察結果

兩組病人用藥前的癥侯積分為（17.65±1.67）和（17.72±1.51），兩者對比差異無統計學意義（

t

=0.217，

P

=0.829），具有可比性；用藥4周后，對照組積分為（9.43±2.41），觀察組積分為（4.31±1.28），與治療前比較，明顯降低，差異有統計學意義（

t

=-13.310，

P

＜0.001），證明兩組用藥都有效；治療4周后，觀察組與對照組相比，積分數更低，差異有統計學意義（

P

＜0.001）；觀察組服藥4周后療效顯著優于對照組，差異有統計學意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方治療冠心病期前收縮97例臨床療效比較

2.2 網絡藥理學研究結果

2.2.1 藥物與疾病的靶標篩選

本研究共篩選得到梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方82個藥物活性成分及191個不同作用靶標（見表2），冠心病期室性前收縮疾病作用靶標2 658個。藥物與疾病重合的作用靶標共132個（見圖1）。

圖1 藥物與疾病靶標韋恩圖

表2 梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方有效成分與靶標

2.2.2 藥物活性成分-靶標網絡分析

將所篩選出的有效藥物成分與相關靶標信息構建“成分-靶標”網絡（見圖2，藍色長方形為藥物作用靶標，紫色三角形梔子活性成分，紫色菱形淡豆豉活性成分，綠色三角形牡丹皮活性成分，綠色菱形白術有效成分，黃色三角形茯苓有效成分，黃色菱形白芍有效成分，紅色菱形柴胡活性成分，紅色三角形多藥共有的活性成分），藥物活性成分中degree≥10的分別是：槲皮素（quercetin，值為99）、山奈酚（kaempferol，值為41）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，值為24）、豆甾醇（Stigmasterol，值為19）、異鼠李素（isorhamnetin，值為21）、黃豆黃素（glycitein，值為16）、5-羥基-7-甲氧-2-（3，4，5-三甲氧苯基）色原酮［5-hydroxy-7-methoxy-2-（3，4，5-trimethoxyphenyl）chromone，值 為16］、3β-乙酰氧基蒼術酮（3β-acetoxyatractylone，值為10）；這些高相關性有效成分中，屬于梔子的有5種，屬于柴胡的有4種，屬于牡丹皮、當歸、白芍的各有2種，屬于淡豆豉、白術的各有1種。

圖2 藥物與疾病“成分-靶標”交互網絡圖

2.2.3 GO分析

分別對靶標蛋白進行BP、CC、MF富集分析，保留p≤0.01的結果，并分別對前20個條目進行可視化分析，得到氣泡圖（如圖3，縱坐標表示富集條目，橫坐標表示基因所占比例，圖中圓形面積越大代表富集基因數目越多，顏色越紅代表富集程度越顯著）。主要BP富集條目有對類固醇激素反應（response to steroid hormone）、對活性氧的反應（response to reactive oxygen species）等，主要CC富集條目有細胞外基質（extracellular matrix）、蛋白激酶合成（protein kinase complex）等，主要MF富集條目有蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、抗氧化活性（antioxidant activity）等。

2.2.4 KEGG通路富集分析

通過網絡藥理學的KEGG_PATHWAY通路注釋分析，獲取了梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方的主要藥理學作用通路166條（Count≥2，P-Value≤0.05），進行可視化分析，得到氣泡圖（如圖3，縱坐標表示富集條目，橫坐標表示基因所占比例，圖中圓形面積越大代表富集基因數目越多，顏色越紅代表富集程度越顯著）?？梢娭饕婕癙I3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。

圖3 梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方主要作用靶標富集氣泡圖:A為生物過程分析（BP）；B為細胞組成分析（CC）；C為分子功能分析（MF）；D為京都基因與基因組百科全書（KEGG）

2.2.5 構建靶標-通路圖

將通路條目、靶標信息繪制得到靶標-通路圖（藍色長方形代表靶標，紫色V字型代表通路，面積越大富集越顯著），其中degree≥10的靶標有：MAPK1、AKT1、RELA、MAPK8、MAPK10、JUN、MAPK14、RAF1、IL6、FOS，見圖4。

圖4 梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方主要作用靶標-通路圖

3 討論

冠心病病人常伴發室性期前收縮，部分病人只在行心電圖檢查時可見，而癥狀不明顯，但亦多有以“心悸”為主癥者，病人可見陣發或持續的心中悸動、驚惕不安，不能自主的一種自覺癥狀。中醫藥治療此類慢性疾病有獨到作用，但需精準辯證論治，才能取得理想療效。該病脈診可見節律失調，如“代脈”“促脈”。病因多為氣機失于疏達，血脈失于通利，心主脈，肝主血，心主藏神，肝主疏泄，故中醫辨證心悸之證當與心、肝兩臟關系密切。有學者收集中國期刊全文數據庫（CNKI）中運用中藥自擬方治療室性早搏的文獻并做篩選，得到326首方劑，涉及中藥208味，應用中醫傳承輔助平臺軟件建立數據庫，發現方藥應用多歸心、肝、脾經，以補虛藥、活血化瘀藥、安神藥、清熱藥為主。筆者臨床觀察中發現“心悸”病例多為“肝郁血虛，郁熱內盛”之證，與近年報道較多的證候相印證，本研究所用梔子豉湯和丹梔逍遙散化裁方針對該證，并隨證變化。

梔子豉湯出自《傷寒論》，清熱除煩以寬胸；丹梔逍遙散在逍遙散基礎上發展而來，逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，養血健脾，疏肝清熱，加入生丹皮、炒梔子，則為丹梔逍遙散，對氣郁化火之心慌胸悶療效更佳。方中梔子上入心胸，清透郁熱以除煩，導火下行以除熱；豆豉透邪暢中，宣泄胸中郁熱而助梔子除煩，又能開壅散滿而和胃；生丹皮清熱涼血，活血化瘀；柴胡疏肝解郁，以調達肝氣；當歸養血和血；白芍養血斂陰，柔肝緩急；白術、茯苓健脾以助運化，使氣血生化有源。其中梔子、柴胡、牡丹皮、當歸、白芍、白術、茯苓均為近年報道中治療室性期前收縮方劑組成出現頻率較高的藥物。

經網絡藥理學數據發掘共得到藥物活性成分大多屬于黃酮類及甾醇類化合物，根據這些藥物活性成分與疾病靶標的相關性分析，考慮梔子與柴胡可能在該方治療冠心病室性期前收縮中起主要作用。以往研究證實黃酮類化合物在缺血再灌注大鼠實驗中減少室性逸搏、降低室顫發生率和持續時間，明顯縮小了梗死面積及體積，酰化山奈酚苷類也被證實能夠對充血性心力衰竭和心律失常起到治療作用；甾醇類化合物中β-谷甾醇已被證實具有抗糖尿病、降血脂等作用與心血管疾病有密切關系，豆甾醇具有減少炎性因子和抗氧化作用，并影響細胞凋亡信號通路。

通過GO富集得到許多高相關性的富集條目，其中對類固醇激素反應：有研究證實雌激素可能對室性心律失常有保護作用，急性心肌缺血-再灌注過程中生理濃度睪酮的急性過量灌注可通過清除促心律失常基質誘導傳導阻滯和降低室性期前收縮的觸發活性。對活性氧反應：有研究發現心臟線粒體K（ATP）通道開放可能影響并觸發心肌促氧化/抗氧化平衡的改變，在長時間缺血期間減少活性氧的產生。細胞外基質：有學者研究證實冠狀動脈疾病引起的缺血性心肌病的差異表達蛋白大部分與細胞外基質、代謝、免疫應答、肌肉收縮、細胞骨架組織、轉錄/翻譯、信號轉導等相關。蛋白激酶合成、蛋白磷酸酶結合：抑制磷酸酶可通過激活蛋白激酶AMPKCREB-Mfn2-mitophagy信號通路促進內皮細胞存活，影響心血管動脈硬化的發生發展；磷脂酰肌醇3-激酶γ通過蛋白激酶A介導的不同磷酸二酯酶的調節對兒茶酚胺誘發的室性心律失常具有保護作用。

通過KEGG通路分析，預測了梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方治療冠心病室性期前收縮可能的主要藥理學作用通路，其中PI3K-Akt信號通路：已有學者通過對中藥成分白藜蘆醇的研究證實其就是通過PI3K/Akt信號途徑增加心肌連接蛋白43的含量和活性，從而預防再灌注心律失常的發生；MAPK信號通路：有實驗證實中藥成分烏頭堿誘導的鈣超載通過p38 MAPK信號通路引起心律失常和細胞凋亡；IL-17信號通路：IL-17及其下游靶基因已被證實可能在缺血性心力衰竭的室性心律失常誘導中起重要作用；Toll樣受體信號通路：有實驗證實Toll樣受體4激活通過IRF3依賴和MyD88獨立途徑降低短暫外向鉀電流促進心律失常的發生，心肌缺血再灌注時Toll樣受體2信號轉導可觸發致命性心律失常。通過靶標-通路圖的繪制，我們發現：MAPK1、AKT1、RELA、MAPK8、MAPK10、JUN、MAPK14、RAF1、IL6、FOS均與富集通路具有顯著的相關性。已有研究證實MAPK通路的激活在室性心律失常的發生中起重要作用；RAF1是MAPK通路上重要組成；IL-6則被證實與QT間期的延長獨立相關；缺血損傷凋亡信號系統JNK/c-JUN及AKT激酶可能在缺血再灌注損傷的治療中發揮作用。

本研究的臨床的部分，我們觀察到梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁用于治療以“心悸”為中醫診斷、證屬“肝郁血虛、郁熱內盛”的冠心病室性期前收縮，中醫證候改善顯著，療效滿意。通過網絡藥理學研究得到梔子豉湯合丹梔逍遙散化裁方治療冠心病室性期前收縮的多個活性成分、相關作用靶標及可能的作用通路，體現了中藥復方多靶點多作用通路的特點，為中藥復方用于治療冠心病室性期前收縮提供了理論依據，也為進一步提取中藥有效成分研制冠心病室性期前收縮藥物提供思路。