基于毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的活性細(xì)菌表面增強(qiáng)拉曼散射傳感

張 萌，陳東圳，寧 攀，任研偉，李 陽，張 亮

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061；2.西安工程大學(xué)材料工程學(xué)院，紡織行業(yè)功能感知纖維及異形織造技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710048；3.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710049）

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）是一種超靈敏的光譜分析技術(shù)［1］。該技術(shù)主要利用激光激發(fā)產(chǎn)生的局部表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSPR）效應(yīng)進(jìn)行傳感分析。該效應(yīng)可以放大貴金屬納米結(jié)構(gòu)表面的局部電磁場強(qiáng)度，極大地增強(qiáng)吸附或者靠近貴金屬納米結(jié)構(gòu)表面靶標(biāo)分子的拉曼信號(hào)，從而產(chǎn)生SERS指紋譜信號(hào)，并從SERS信號(hào)中獲取分子的結(jié)構(gòu)信息。SERS技術(shù)已被應(yīng)用于各種生物分子、生物細(xì)胞的無損檢測，靈敏度甚至可以達(dá)到單分子水平［2］。毫無疑問，SERS技術(shù)具有良好的傳感靈敏度，在微生物細(xì)胞的檢測中具有獨(dú)到的優(yōu)勢。細(xì)菌是一種對人類社會(huì)產(chǎn)生巨大危害和影響的微生物，合理的研究利用SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對活性細(xì)菌的快速和原位檢測具有重要意義［3］。如評估抗生素的功效、對抗“超級細(xì)菌”感染或抗菌素耐藥性等［4］。一般的SERS增強(qiáng)基底材料均具有較強(qiáng)的殺菌能力，而活性細(xì)菌的原位檢測難度較大。

基于上述存在的問題，本研究團(tuán)隊(duì)前期開發(fā)了一種Ta原子摻雜的Ta@Ag多孔薄膜，Ta原子的摻雜有效抑制了Ag納米結(jié)構(gòu)的殺菌性能，提高了Ag納米表面的生物相容性，實(shí)現(xiàn)了活性細(xì)菌的原位檢測分析［5］。然而，由于Ta@Ag多孔薄膜是一種平面二維結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)菌吸附于薄膜表面時(shí)，Ta@Ag薄膜表面的光激發(fā)等離子體共振區(qū)域通常被細(xì)菌覆蓋，獲得穩(wěn)定的SERS信號(hào)具有一定困難。此外，研究發(fā)現(xiàn)，“納米間隙”和“納米針尖”結(jié)構(gòu)能極大放大局部電磁場強(qiáng)度，形成SERS“熱點(diǎn)”區(qū)域，提高檢測的靈敏度［6-8］。因此，等離子體“納米間隙”和“納米針尖”結(jié)構(gòu)是一種極為有效的SERS增強(qiáng)基底［6-8］。研發(fā)具有較高SERS信號(hào)靈敏度、良好細(xì)菌細(xì)胞生物兼容性的等離子體貴金屬納米結(jié)構(gòu)具有重要意義。

本論文通過使用無機(jī)的雙氧水作為“清潔”還原劑，無機(jī)硝酸銀作為反應(yīng)調(diào)控劑，在低溫下（10℃）進(jìn)行各相異性生長，制備出一種毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒。首先，該納米結(jié)構(gòu)表面分布有致密的單晶“納米針尖”，在適合波長的激發(fā)光激發(fā)下，可產(chǎn)生極強(qiáng)的LSPR效應(yīng)，從而形成致密分布的SERS“熱點(diǎn)”。其次，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒具有較好的細(xì)菌生物兼容性，細(xì)菌吸附該納米結(jié)構(gòu)仍能保持良好的生物活性。最后，在細(xì)菌表面吸附毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒，并采用633 nm的激發(fā)光激發(fā)納米結(jié)構(gòu)表面的LSPR效應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌表面功能化學(xué)基團(tuán)的原位檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

試驗(yàn)中所用到的主要化學(xué)藥品均為分析純，分別有硝酸銀、雙氧水、氯金酸等。試驗(yàn)中使用的主要設(shè)備有：玻璃反應(yīng)瓶、 全自動(dòng)數(shù)控干燥箱、分析天平、攪拌器、離心機(jī)、數(shù)控超聲波清洗器等。采用的細(xì)菌是大腸桿菌（Esherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)制備

將0.45 mL的HAuCl4水溶液（12.50 mol/L）加入燒瓶，加入10 mol/L 的硝酸銀水溶液，緊接著加入90 μL的金種子溶液和30 μL的冰水。然后，將燒瓶放入10℃的水浴中，磁力攪拌（200 r/min）10 min，滴加堿性雙氧水溶液還原HAuCl4。磁力攪拌反應(yīng)10 min后，離心收集制備的納米結(jié)構(gòu)。

1.2.2 材料結(jié)構(gòu)表征

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FEI Verios 460）和透射電子顯微鏡（JEM-200CX）進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)形貌的表征；X射線能譜（energy dispersive X-ray spectrometer，EDS）分析采用能譜儀（EDS-OCTANE plus module）進(jìn)行表征；紫外可見吸收光譜采用的光譜儀型號(hào)為Lambda 950；拉曼光譜采用激光拉曼光譜儀（HORIBA, LabRAM HR Evolution）進(jìn)行表征分析。

1.2.3 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞相容性測試

細(xì)菌的生物活性采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行研究。將0.5 mL的原始濃度、二分之一濃度、四分之一濃度、八分之一濃度的毛丹狀A(yù)u@Ag合金多級納米顆粒溶液紫外照射60 min殺菌，然后分別與革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）液進(jìn)行1∶1體積的混合，室溫下作用3 h后取100 μL的大腸桿菌懸浮液涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，通過菌落數(shù)量計(jì)算細(xì)菌的存活率。

1.2.4 SERS檢測

首先，將毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)與細(xì)菌細(xì)胞滴加混合；然后，將表面吸附有Au@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的細(xì)菌滴加至硅片表面；最后，置于拉曼光譜儀信號(hào)采集平臺(tái)進(jìn)行檢測，激發(fā)光波長選擇633 nm，積分時(shí)間為1～15 s，激發(fā)光功率為1～5 mW。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)

采用濕化學(xué)還原反應(yīng)法制備毛丹狀A(yù)u@Ag合金多級納米結(jié)構(gòu)。如圖1a所示，毛丹狀A(yù)u@Ag合金多級納米結(jié)構(gòu)表面呈現(xiàn)出致密的納米針尖結(jié)構(gòu)（圖1a），納米顆粒平均直徑約為80 nm，表面致密的納米針尖分布清晰可見，其中大量分布的致密的納米針尖可產(chǎn)生較高的納米級粗糙度，致密的納米針尖之間可形成大量的納米間隙區(qū)域，該納米間隙區(qū)域也可產(chǎn)生較大的比表面積，有利于提高單個(gè)毛丹狀A(yù)u@Ag合金多級納米結(jié)構(gòu)對靶標(biāo)分子的吸附能力。圖1b為單個(gè)毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒表面局部放大的透射電子顯微鏡圖像（transmission electron microscope image，TEM）形貌圖，分析發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)納米針尖呈現(xiàn)出單晶結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，“納米間隙”和“納米針尖”結(jié)構(gòu)均為極好的SERS“熱點(diǎn)”結(jié)構(gòu)，吸附于該結(jié)構(gòu)區(qū)域的靶標(biāo)分子可產(chǎn)生明顯的SERS信號(hào)［8-9］。然而，在常用的SERS檢測中，制備 “納米間隙”和“納米針尖”表面結(jié)構(gòu)具有較大困難［10］。水熱反應(yīng)或者濕化學(xué)合成工藝通常使用足量的表面活性劑分子和有機(jī)還原劑分子，這種吸附行為會(huì)產(chǎn)生阻擋效應(yīng)，增加靶標(biāo)分子吸附在“納米間隙”或“納米針尖”區(qū)域中的阻力，從而降低SERS信號(hào)的靈敏度［3，5-6，11］。因此，本研究采用堿性無機(jī)雙氧水作為還原劑，并以無機(jī)硝酸銀鹽作為誘導(dǎo)劑，從源頭避免引入任何表面活性劑和有機(jī)還原劑，最后制備出了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)。分析發(fā)現(xiàn)，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)生長過程分為兩步：1）氯金酸、硝酸銀還原產(chǎn)生的金、銀原子沉積在金種子表面，并形成大量生長位點(diǎn)，較低的反應(yīng)溫度（10℃）導(dǎo)致較慢的反應(yīng)速率［8，14-18］；2）還原產(chǎn)生的銀原子通過欠電位沉積，選擇性地吸附在不同晶面，這種對晶面的選擇性吸附效應(yīng)抑制了金原子在特定晶面的沉積，最終產(chǎn)生各向異性的生長［3，12-16］，并形成具有多針尖的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)（圖1a、1b）。

圖1 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)Fig.1 Rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

2.2 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)對細(xì)菌細(xì)胞的吸附及細(xì)菌兼容性

依據(jù)Song等［17］的報(bào)道 ，高表面粗糙度的花粉狀納米結(jié)構(gòu)對細(xì)胞表面具有很強(qiáng)的黏附能力。毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)具有多針狀的表面結(jié)構(gòu)和較高的納米級表面粗糙度。因此，本研究分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌與毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)混合，然后觀察毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)在細(xì)菌表面的吸附能力。TEM表征發(fā)現(xiàn)，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)在細(xì)菌表面具有很強(qiáng)的吸附能力（圖2）。因此，可有效利用毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)菌表面的SERS傳感分析。

圖2 細(xì)菌細(xì)胞吸附毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒Fig.2 Bacterial cell absorbed by rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

此外，基于平板計(jì)數(shù)法，本研究進(jìn)一步分析了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒對細(xì)菌細(xì)胞的生物兼容性。不同濃度的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)作用于革蘭氏陰性菌（大腸桿菌），孵育一定時(shí)間。然后，將大腸桿菌懸浮液接種在固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16 h，通過菌落數(shù)量觀察細(xì)菌的存活數(shù)量。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒和大腸桿菌孵育作用后，大腸桿菌均能繁殖生長出較致密的菌落（圖3），不同的存活率均在誤差可接受的范圍。由圖3、4的數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒對于大腸桿菌具有較好的生物兼容性，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒溶液與大腸桿菌孵育作用后，大腸桿菌仍能保持較高的生物活性。在大腸桿菌的兼容性試驗(yàn)中，Au@Ag合金納米顆粒對其具有較好的兼容性。分析認(rèn)為，本文制備的是一種Au@Ag合金納米球，Au是人類發(fā)現(xiàn)的化學(xué)性能最穩(wěn)定、生物相容性最好的金屬元素之一，因此對不同的微生物細(xì)胞具備普遍適用的生物相容性。

圖3 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒細(xì)菌細(xì)胞生物兼容性測試Fig.3 Biocompatibility test of bacterial cell for rambutan-like Au@Ag alloy nanoparticles

2.3 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)LSPR性能分析

金、銀納米結(jié)構(gòu)的光學(xué)性能受控于納米結(jié)構(gòu)的形貌。研究發(fā)現(xiàn)，納米球、納米棒、納米立方體、納米八面體、納米十面體以及納米二十面體等一系列不同的納米結(jié)構(gòu)具有不同的光學(xué)性能［18］。其中的分支狀或者星形金、銀納米結(jié)構(gòu)受到了研究人員的廣泛關(guān)注。試驗(yàn)研究和理論計(jì)算分析表明，星形納米結(jié)構(gòu)的納米針尖和納米間隙能產(chǎn)生極強(qiáng)的局部電磁場強(qiáng)度放大，而與其相關(guān)的LSPR 帶通常位于可見光到近紅外光波長范圍，使得該類納米結(jié)構(gòu)在SERS生物傳感分析中具有極大優(yōu)勢。本研究提出的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)表面具有致密的納米針尖結(jié)構(gòu)。 因此，本研究采用紫外吸收可見光譜和時(shí)域有限差分法研究了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的光學(xué)性能。

研究發(fā)現(xiàn)，制備的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的LSPR特征峰及特殊的光學(xué)性能。圖5a展示了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的紫外可見吸收光譜，其吸收峰位于 630 nm 波長。這一波長與SERS檢測中常用的633 nm的激發(fā)波長相匹配，因此可以產(chǎn)生表面增強(qiáng)共振拉曼散射，提高SERS分析的靈敏度。位于“納米針尖”或者“納米間隙”區(qū)域位置的電磁場強(qiáng)度的放大是產(chǎn)生拉曼增強(qiáng)的主要因素。為闡明毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)與電磁場強(qiáng)度增強(qiáng)、激發(fā)光波長之間的對應(yīng)關(guān)系，本研究模擬了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)在633 nm激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的局部電磁場強(qiáng)度分布。

首先， 本文根據(jù)毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的TEM，建立了毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的三維物理模型。其次，基于建立的物理模型，研究使用時(shí)域有限差分方法計(jì)算了633 nm激發(fā)光條件下Au@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的表面電磁場強(qiáng)度分布。計(jì)算中入射光設(shè)定為x軸方向，電場方向?qū)?yīng)為y軸方向，磁場方向?qū)?yīng)為z軸方向，網(wǎng)格尺寸設(shè)定為2 nm，并假定計(jì)算模型懸浮于空氣中（n=1.0）。計(jì)算中忽略納米結(jié)構(gòu)的化學(xué)增強(qiáng)效應(yīng)以及銀元素在金銀合金中的影響。分析發(fā)現(xiàn)，在633 nm的激發(fā)光激發(fā)下，“納米針尖”區(qū)域可產(chǎn)生較強(qiáng)的局部電磁場強(qiáng)度放大（圖5b），且毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)周圍存在一定的非定域電磁場分布。這一分析結(jié)果支持采用633 nm的激發(fā)光進(jìn)行后續(xù)的SERS傳感。

圖5 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)的局部表面等離子體共振性能Fig.5 Localized surface plasmon resonance property of rambutan-like Au@Ag alloy nanostructure

圖4 毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒與大腸桿菌細(xì)胞作用后細(xì)菌的存活率Fig.4 The survival rate of Escherichia coli treated by rambutanlike Au@Ag alloy nanoparticles

2.4 SERS細(xì)菌檢測

如圖6所示，將表面吸附有毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒的大腸桿菌滴加至無菌的單晶硅片表面，然后置于拉曼檢測平臺(tái)進(jìn)行檢測。分析發(fā)現(xiàn)，在633 nm的激發(fā)光激發(fā)下，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)表面能夠產(chǎn)生極強(qiáng)的LSPR效應(yīng)。因此，本研究采用633 nm的激發(fā)光，檢測由毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)的細(xì)菌拉曼信號(hào)，測試的SERS光譜如圖6c所示，具體的拉曼特征峰如表1所示。其中典型的拉曼位移位置為560 cm–1、772～910 cm–1、932 cm–1、1 102 cm–1、1 430 cm–1，這些拉曼特征峰位置分別代表糖類、核酸、蛋白質(zhì)ν（C-C）及苯丙氨酸（蛋白質(zhì)）、β-胡蘿卜素及δ（CH2）。此外，使用1 430 cm–1拉曼位移處的特征峰對細(xì)菌表面進(jìn)行成像（圖6b），結(jié)果顯示在局部區(qū)域呈現(xiàn)出較強(qiáng)的SERS信號(hào)，分析認(rèn)為該區(qū)域應(yīng)吸附有較為致密的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒。

圖6 SERS傳感檢測大腸桿菌Fig.6 SERS sensing of E.coli

表1 細(xì)菌的典型拉曼特征峰Tab.1 Typical Raman characteristic peaks of bacteria

本研究將毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒吸附于細(xì)菌表面，然后滴加于硅片表面進(jìn)行細(xì)菌SERS信號(hào)的激發(fā)及收集。本研究設(shè)計(jì)的這種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)主要如下：第一，構(gòu)建的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒具有較高的表面粗糙度和致密的納米針尖結(jié)構(gòu)，能在三維的細(xì)菌表面進(jìn)行吸附［5］，且能保持較高的細(xì)菌生物活性；第二，構(gòu)建的毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒在單顆粒表面具有大量的“納米針尖”和“納米間隙”，這種結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生較強(qiáng)的LSPR效應(yīng)［3］；第三，將毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒吸附于細(xì)菌表面，可以有效地增強(qiáng)細(xì)菌表面的SERS信號(hào)，且制樣簡便，在實(shí)際檢測中容易操作。

3 討論

SERS作為一種檢測細(xì)菌的熱門技術(shù)，一直都是研究者所關(guān)注的焦點(diǎn)。在以往的研究中，多是研究如何增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度，而忽略了大多基底材料具有的殺菌效果。本研究團(tuán)隊(duì)在之前的研究基礎(chǔ)上，采用具有較好細(xì)菌細(xì)胞兼容性的Au@Ag合金納米顆粒，同時(shí)也提出了利用毛膽狀納米結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)拉曼信號(hào)。首先，使用無機(jī)堿性雙氧水作為“清潔”還原劑，還原制備了一種毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒，該制備方法能從源頭避免有機(jī)還原劑、表面活性劑的引入，從而避免有機(jī)分子對SERS基底材料的不可逆吸附和污染。研究發(fā)現(xiàn)，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒對細(xì)菌表面具有較強(qiáng)的吸附能力，且細(xì)菌能保持較高的生物活性，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米顆粒在單顆粒表面具有大量的“納米針尖”和“納米間隙”，這種結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生較強(qiáng)的LSPR效應(yīng)?；谖覀兊募?xì)菌吸附試驗(yàn)，可以肯定的是，毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)對革蘭氏陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌）都具有很好的吸附效果。其主要原因是毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)具有粗糙的表面結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)表面存在類似于花粉顆粒的毛刺狀物理結(jié)構(gòu)，這樣的物理結(jié)構(gòu)必然具有很好的吸附掛載能力。一般情況下，該類結(jié)構(gòu)不管是對細(xì)菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，都具有良好的吸附能力。

本論文的研究，僅對大腸桿菌的生物兼容性進(jìn)行了測試，測試發(fā)現(xiàn)毛丹狀A(yù)u@Ag合金納米結(jié)構(gòu)對大腸桿菌的生物兼容性良好。Au單質(zhì)是人類發(fā)現(xiàn)的化學(xué)性能最穩(wěn)定、生物相容性最好的金屬元素之一。Au@Ag合金納米結(jié)構(gòu)中Au是起主導(dǎo)作用的元素，目前大部分的等離子體生物檢測都會(huì)用到Au納米結(jié)構(gòu)。利用以上特點(diǎn)，本研究檢測了活性細(xì)菌的SERS指紋譜信號(hào)，表明了SERS分析方法能廣泛應(yīng)用于微生物細(xì)胞的檢測分析。