谷子MYB-CC基因家族的鑒定與表達分析

李明明，晉敏姍，胡海斌，王 浩，于港華，邢國芳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

植物轉(zhuǎn)錄因子MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類與調(diào)控植物生長發(fā)育、生理代謝、細胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物中普遍存在，同時也是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的代謝和調(diào)控中發(fā)揮重要作用。磷饑餓響應(yīng)蛋白1（phosphate starvation response1，PHR1）具有MYB和CC（coiled-coil）結(jié)構(gòu)域，被定義為MYB-CC家族。據(jù)報道，這個家族的另外兩個成員也與磷脅迫有關(guān)［1-2］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtPHR1是第一個在維管植物中分離的參與低磷脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控的MYB超級家族轉(zhuǎn)錄因子，其本身不受外界磷水平的調(diào)控。MYB62是另外一個MYB超家族轉(zhuǎn)錄因子，參與低磷脅迫轉(zhuǎn)錄調(diào)控。MYB62與PHR1都是具有R2R3結(jié)構(gòu)域的MYB轉(zhuǎn)錄因子，在低磷脅迫下都能被誘導(dǎo)。與PHR1不同的是，MYB62在低磷脅迫下的誘導(dǎo)具有特異性，AtMYB62在根中的表達量很低，但在苗期葉片中的表達受缺磷誘導(dǎo)［3-4］。當植株恢復(fù)供磷時，AtMYB62的表達量迅速下降，過表達 AtMYB62植株會表現(xiàn)出與缺磷條件下相似的反應(yīng)，如主根生長受到抑制，花青素大量積累，根系酸性磷酸酶活性增加等。研究表明，AtMYB62可能通過調(diào)控赤霉素生物合成途徑中的基因表達來影響植物體內(nèi)赤霉素的濃度，進而調(diào)節(jié)植物對低磷的響應(yīng)［4］。Ren等［5］和Zhang等［6］在甘藍型油菜（Brassica napusL.）中克隆了擬南芥的AtPHR1同源基因，并將其命名為BnPHR1。他們的分析表明：BnPHR1主要在根系中表達，其表達水平受外界磷水平的調(diào)控；在擬南芥和油菜中過表達BnPHR1顯著提高了高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白AtPT2及BnPT2 的表達水平。MYB-CC基因家族的鑒定與分析是進一步研究MYB-CC基因功能和明確其在植物生長發(fā)育過程中作用的重要基礎(chǔ)。谷子（Setaria italica）作為禾本科狗尾草屬的主要物種，其基礎(chǔ)和相關(guān)應(yīng)用研究已經(jīng)引起廣泛重視，但是截至目前，谷子MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子家族成員仍未進行系統(tǒng)的鑒定。

谷子屬于禾本科狗尾草屬二倍體（2n=2x=18）自花授粉一年生草本植物，起源于我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢作物，也是糧飼兼用作物。谷子去殼后的小米是我國北方的重要糧食作物，學(xué)名為粟，小米營養(yǎng)豐富且各種成分均衡，具有很高的營養(yǎng)保健價值，在我們國家被列為“五谷”之首［7-8］。谷子基因組測序計劃已經(jīng)完成，其具有較小的二倍體基因組（500 Mb），具C4光合作用，且能夠在旱地栽培［9-10］。這使得谷子迅速發(fā)展成為C4光合作用和植物耐旱抗逆分子機理研究的模式植物［11-12］。

本研究利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析軟件對谷子的MYB-CC基因家族的組成進行了預(yù)測，并對谷子MYB-CC基因家族成員的蛋白理化性質(zhì)、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、啟動子和基因表達等進行分析，旨在為進一步鑒定和克隆谷子耐低磷基因、挖掘相關(guān)耐低磷基因資源奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子的全基因組數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)序列均來自于Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），擬南芥MYB-CC基因的蛋白序列來自TAIR數(shù)據(jù)庫（https://www.arabidopsis.org/）。

1.2 谷子MYB-CC基因家族的鑒定及蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲取已報道的玉米MYB-CC基因的蛋白序列［13］，登陸Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.sanger.ac.uk）下載該基因隱馬爾科夫模型文件MYB-CC_LHEQLE結(jié)構(gòu)域（PF14379），把該文件提交至TBtools軟件的Simple HMM Search，將得到的所有谷子、擬南芥和水稻基因的蛋白序列提交到NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）進行結(jié)構(gòu)域驗證，除去無MYBCC典型結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域不完整和冗余序列后，最終獲取到谷子的18個MYB-CC基因、擬南芥的12個MYB-CC基因和水稻的16個MYB-CC基因。利用ExPASY-ComputepI/Mw 在線軟件（https://web.expasy.org/compute_pi/）和 ExPASY-ProtParam （https://web.expasy.org/protparam/）分析谷子MYB-CC基因的蛋白質(zhì)序列的等電點、相對分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)。利用在線軟件SOPMA對MYB-CC基因單條序列α-螺旋、β-折疊、延伸鏈等二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。通過在線軟件ProtComp 9.0（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&to pic=protcomppl）和SignalIP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對谷子的MYB-CC的蛋白質(zhì)序列進行亞細胞定位及信號肽預(yù)測。

1.3 谷子MYB-CC基因家族染色體定位和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

從谷子基因組數(shù)據(jù)庫（V12.1，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中獲取谷子MYB-CC基因的染色體位置信息，利用TBtools工具對谷子MYBCC基因的染色體定位進行可視化分析，繪制染色體分布圖。以Cluatal X2軟件［14］對谷子、擬南芥、水稻MYB-CC基因的蛋白質(zhì)序列進行多重序列比對，并在MEGA 5.0軟件［15］中以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap replications數(shù)目設(shè)置為1 000）。

1.4 谷子MYB-CC基因家族基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

通過在線軟件MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）［16］分析谷子MYB-CC蛋白的motif組成，最大保守序列鑒定數(shù)目設(shè)置為6。利用TBtools工具繪制谷子MYB-CC基因家族的進化樹、基因結(jié)構(gòu)和保守基序聯(lián)合分析圖。

1.5 谷子MYB-CC基因家族順式作用調(diào)控元件分析

以谷子全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用TBtools工具獲取谷子MYB-CC基因上游2 000 bp的啟動子序列，然后提交至PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［17］，進行順式作用調(diào)控元件統(tǒng)計分析。

1.6 谷子MYB-CC基因家族基因表達分析

為了分析谷子MYB-CC基因的組織表達特異性，本研究從本實驗室小米基因組網(wǎng)站（http://foxtail-millet.biocloud.net/home）獲得不同組織的基因表達量值并進行匯總，最后利用TBtools工具繪制基因表達熱圖。

1.7 基因的熒光定量表達分析

使用RNAiso Plus提取RNA，用 Takara 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA第1條鏈， 以各樣品的cDNA為模板，濃度統(tǒng)一稀釋為200 ng/μL, 進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）擴增，EF1a為內(nèi)參基因［18］，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR引物（表1）。反應(yīng)體系為10.0 μL，包含5.0 μL TB Green Premix Ex Taq II、3.6 μL ddH2O、正反向引物各0.2 μL、1.0 μL cDNA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。采用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量［19］。

表1 定量PCR引物Tab.1 The primer sequences for qRT PCR

1.8 谷子MYB-CC基因的共線性及選擇壓力分析

使用TBtools工具的多個子程序，采用默認參數(shù)來分析3個物種MYB-CC基因之間的共線性關(guān)系。獲得谷子、水稻和玉米MYB-CC基因的共線性對基因，使用TBtools軟件的ka/ks Calculator程序?qū)簿€性基因進行非同義替換（non-synonymous substitution，ka）和同義替換（synonymous substitution，ks）分析［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子MYB-CC基因家族的序列鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)基因在谷子染色體上的定位情況，將其分別依次命名為SiMYB-CC1～SiMYB-CC18（圖1）。這些基因分布在7條不同染色體上，其中2號染色體上最多（4個），7號染色體上最少（1個）。

圖1 MYB-CC基因的染色體定位Fig.1 Chromosome location of MYB-CC genes in foxtail millet

將這18個MYB-CC基因的染色體位置、基因組位置、氨基酸數(shù)目、等電點和相對分子質(zhì)量等信息進行整理（表2）。由表2可知，谷子的MYBCC基因分布于7條染色體上，它們的編碼長度為227～473個氨基酸，等電點（pI）為5.08～9.49，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為24 977.41～51 795.39 Da。不穩(wěn)定系數(shù)分析表明，SiMYB-CC3、SiMYB-CC11、Si-MYB-CC10、SiMYB-CC16、SiMYB-CC13的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定性蛋白，其他13個基因蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，為不穩(wěn)定性蛋白。

表2 谷子MYB-CC基因家族成員基本信息及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab.2 Basic information and protein physicochemical properties of MYB-CC gene family members of foxtail millet

對谷子的18個MYB-CC家族成員蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明，各成員的二級結(jié)構(gòu)中均含有α-螺旋、β-折疊、直鏈延伸和無規(guī)則卷曲。其中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲作為谷子MYB-CC蛋白家族成員二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件，占二級結(jié)構(gòu)總量的25%～70%，有利于蛋白質(zhì)特殊結(jié)構(gòu)構(gòu)象的形成；β-折疊、直鏈延伸的占比則相對較少（表3）。

表3 谷子MYB-CC基因家族成員二級結(jié)構(gòu)占比Tab.3 Proportion of secondary structure of MYB-CC genes in foxtail millet

2.2 谷子、擬南芥、水稻MYB-CC基因家族的進化分析

為闡明谷子MYB-CC基因家族的進化關(guān)系，將擬南芥（12個）、水稻（16個）和谷子（18個）共46個MYB-CC基因，在MEGA 5.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，谷子中的MYB-CC基因家族被分為兩大亞類（圖2）。其中，第 I 類亞家族中有10個谷子MYB-CC家族成員與 6個擬南芥及7個水稻MYBCC家族成員；第II 類亞家族中谷子的SiMYB-CC6和水稻的LOC-Os09g12770.1、SiMYB-CC14、LOCOs08g25820.1、SiMYB-CC9、LOC-Os05g41240.1有直系同源的關(guān)系。由此可以看出，谷子與水稻親緣關(guān)系較近，與擬南芥親緣關(guān)系較遠。

圖2 谷子、擬南芥、水稻MYB-CC基因家族的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of MYB-CC gene family in S.italica, A.thaliana, O.sativa L.

2.3 谷子MYB-CC基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

為了進一步了解谷子MYB-CC基因家族成員的功能，本文對谷子MYB-CC基因家族成員進行了基因結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果如圖3所示。在谷子MYBCC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)中，除SiMYB-CC5和SiMYB-CC9這2個成員均不含有非翻譯區(qū) (untranslated region，UTR)外，其余16個成員均同時具有5'端和3'端非翻譯區(qū)。

圖3 MYB-CC基因進化及結(jié)構(gòu)、基序分析Fig.3 MYB-CC gene evolution, structure and motif analysis

對MYB-CC基因氨基酸序列進行保守基序分析，分別命名為motif 1～6。結(jié)果顯示：絕大多數(shù)谷子MYB-CC家族基因中僅存在1個相對保守的基序motif 1以及2個潛在的保守基序motif 2和 motif 3；除了SiMYB-CC9基因沒有motif 2以外，其余17個基因均含有motif 2；值得一提的是，18個SiMYBCC基因中，8個谷子基因的保守基序排布順序均為motif 3、motif 1、motif 2。這表明谷子MYB-CC基因中的保守基序保守性較強。

2.4 谷子MYB-CC基因順式作用調(diào)控元件

為了更深入地了解谷子MYB-CC基因家族可能潛在的功能，本研究對其啟動子區(qū)的順式作用元件進行了分析。18個谷子MYB-CC基因家族啟動子區(qū)所含順式作用元件主要為兩類：一類是與植物生長發(fā)育有關(guān)的元件，另一類是與逆境響應(yīng)相關(guān)的元件。除了SiMYB-CC2、SiMYB-CC13基因以外，其余16個谷子MYB-CC基因啟動子區(qū)域都含有脫落酸響應(yīng)元件（abscisic acid response element，ABRE），其中SiMYB-CC3基因含有ABRE的數(shù)目最多，達到10個。在18個谷子MYB-CC基因中，都主要存在光響應(yīng)元件（Sp1）；SiMYB-CC3、SiMYB-CC9基因啟動子區(qū)存在生長素響應(yīng)元件（TGA-element）；SiMYBCC2、SiMYB-CC12、SiMYB-CC15基因啟動子區(qū)存在水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）、生長素響應(yīng)元件；SiMYB-CC12、SiMYB-CC15基因啟動子區(qū)存在赤霉素（P-box）、水楊酸、生長素響應(yīng)元件；值得注意的是，SiMYB-CC15基因啟動子區(qū)存在脫落酸、赤霉素、水楊酸、低溫（LTR）、干旱誘導(dǎo)相關(guān)MYB結(jié)合位點（TGACG-motif）、生長素響應(yīng)元件（表4、5）。結(jié)合基因結(jié)構(gòu)的分析，初步推測SiMYB-CC15基因啟動子可能會更快地響應(yīng)一些逆境脅迫，極有可能在低磷條件下快速表達，其具體功能有待后續(xù)進一步驗證。

表4 谷子MYB-CC基因啟動子順式作用調(diào)控元件Tab.4 The cis-acting regulatory elements of foxtail millet MYB-CC gene promoter

表5 谷子MYB-CC基因啟動子順式作用調(diào)控元件核心序列及功能Tab.5 Core sequences and function of the cis-acting regulatory elements of the MYB-CC gene promoters in foxtail millet

2.5 谷子MYB-CC基因組織特異性和環(huán)境誘導(dǎo)表達分析

為了分析MYB-CC基因家族成員在不同組織中的表達特異性，本試驗利用谷子在不同時期和不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對MYB-CC基因家族的表達結(jié)果進行分析。從圖4中可以看出：除SiMYBCC8、SiMYB-CC3、SiMYB-CC16、SiMYB-CC10、Si-MYB-CC11在各組織中的表達較弱外，其余基因的表達均較強；值得注意的是，SiMYB-CC6和SiMYBCC15在植株整個苗期的過程和灌漿期的根、莖中的表達量都比較高。

圖4 谷子MYB-CC基因表達可視化Fig.4 Visualization of MYB-CC gene expression in foxtail millet

2.6 谷子MYB-CC基因在不同谷子品種中各組織的表達量分析

磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白AtPht1;1和AtPht1;2在植物正常條件下和低磷條件下的磷吸收過程中發(fā)揮重要作用［21］。采用qRT-PCR進一步確定從表達圖譜中篩選出來的組織表達特異性較為明顯的1個MYB-CC基因的表達模式，所取樣品為實驗室前期鑒定出的磷耐受和磷敏感材料。設(shè)兩個磷濃度處理：正常供磷（0.250 mmol/L，NP）與低磷處理（0.005 mmol/L，LP）。不同磷耐受型谷子的基因表達量因處理時間不同而不同，MYB-CC轉(zhuǎn)錄因子基因SiMYB-CC6（Seita.2G168900.1）在磷脅迫處理后6 h時，地上部表達量達到最大值，且其表達量在品種間和處理間的差異最大。磷耐受和磷敏感型谷子根系的基因表達量存在差異，低磷條件下，磷耐受品種的轉(zhuǎn)錄因子基因SiMYB-CC6（Seita.2G168900.1）在6 h通過上調(diào)表達從而調(diào)控下游基因，促進植株對磷的吸收，增強其對磷脅迫的耐受性（圖5）。

圖5 不同基因型谷子在不同磷處理下的基因表達分析Fig.5 Gene expression analysis of different genotypes of foxtail millet under different phosphorus treatments

2.7 谷子MYB-CC基因共線性及進化選擇分析

通過共線性分析可以得知不同物種基因間的共線性關(guān)系（圖6），使用TBTools工具將谷子MYBCC基因家族基因與水稻、玉米的共線性結(jié)果進行可視化，并對共線性基因進行進化選擇壓力分析，獲得ka、ks和ka/ks結(jié)果。在進化選擇壓力分析中，ka表示非同義替換，ks表示同義替換，ka/ks的比值可以反映基因在生物進化過程中所受到的選擇壓力。如果ka/ks>1，可認為有正選擇作用；ka/ks=1，認為存在中性選擇；如果ka/ks<1，可認為受到純化選擇。從圖6中可以看出，共存在34對共線性基因，對這34對共線性基因進行進化選擇分析，結(jié)果表明，這些基因的ka/ks值均小于1，這表明MYBCC基因家族在進化過程中可能受到了強烈的純化選擇壓力（表6）。

表6 MYB-CC基因進化選擇壓力分析Tab.6 Analysis of selection pressure in MYB-CC gene evolution

圖6 谷子與水稻、玉米MYB-CC基因共線性分析Fig.6 Collinearity analysis of MYB-CC gene in foxtail millet, rice and maize

3 討論

谷子屬于禾本科狗尾草屬二倍體作物，且為典型的C4作物。已有研究表明，在擬南芥和水稻中大多數(shù)磷饑餓基因都是在AtPHR1和OsPHR2以及其同源基因AtPHL1、AtPHL2、OsPHR1和OsPHR3控制下被誘導(dǎo)激活的［22-23］。

本研究鑒定篩選得到了 18個谷子MYB-CC家族基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、表達模式等進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在谷子MYB-CC基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)中，除SiMYB-CC5和SiMYB-CC9這2個成員均不含有非翻譯區(qū)外，其余16個成員均同時具有5'端和3'端非翻譯區(qū)。18個SiMYB-CC基因中，8個谷子基因的保守基序排布順序均為 motif 3、motif 1、motif 2。這表明谷子MYB-CC基因中的保守基序具有較強的保守性。MYB-CC家族基因啟動子順式作用元件預(yù)測到光響應(yīng)、脫落酸、赤霉素、水楊酸、低溫、干旱誘導(dǎo)相關(guān)MYB結(jié)合位點、生長素響應(yīng)元件。其中，SiMYB-CC15這個基因的啟動子順式作用元件預(yù)測到與植物激素、逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)，表明谷子MYB-CC家族基因可能會更快地響應(yīng)逆境脅迫。Zhou等［24］研究發(fā)現(xiàn)phR2突變體中無機磷大量積累是由高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白PHT1;8的上調(diào)表達所致。植物在長期的進化過程中形成了復(fù)雜的低磷響應(yīng)機制，以適應(yīng)低磷生存環(huán)境。谷子與水稻共線性的基因數(shù)目較多，表明谷子MYB-CC家族基因與水稻中的基因存在較近的親緣性。對共線性基因進行選擇壓力分析表明，谷子MYB-CC家族基因與水稻和玉米的 ka/ks 值均小于1，表明谷子MYB-CC家族基因在與水稻、玉米基因的進化中可能受到了純化選擇作用。

據(jù)報道，玉米中大多數(shù)MYB-CC基因在所有組織中均有連續(xù)表達，表明它們可能在調(diào)節(jié)磷攝取和易位方面起著重要作用［25］。本研究對谷子MYB-CC家族基因在葉、莖、穗和根中的組織表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)谷子MYB-CC家族基因存在組織特異性表達，這與其他禾本科作物MYB-CC基因的表達情況相似。此外，SiMYB-CC6在低磷脅迫后6 h時，表達量遠超過了脅迫前的表達水平，故可以推測SiMYB-CC6可能與非生物逆境下促進植株對磷的吸收，增強其對磷脅迫的耐受性有關(guān)。

本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定，初步對谷子MYB-CC家族基因進行了分析，為后續(xù)狗尾草屬植物生長發(fā)育相關(guān)MYB-CC基因的克隆和功能研究奠定了理論基礎(chǔ)，并初步發(fā)現(xiàn)該基因家族成員參與谷子低磷脅迫響應(yīng)，為植物耐低磷分子研究提供了研究基礎(chǔ)。