基于蛋白互作和關鍵作用靶點的網絡藥理學研究當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的作用機理

張水冰，李 穎，趙思怡，黃 帆，海那爾·烏拉孜巴依，丘明旺，方婉儀，姚 琳，張茂祥

（廣州中醫藥大學，廣州 510405）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是由于纖維環無法限制椎間盤內容物即髓核的突破，進而壓迫腰椎神經根和硬膜囊，早期引起腰痛繼而可能發展為坐骨神經痛的腰椎間盤退行性異常綜合征［1］。近年有研究表明，腰椎間盤突出癥的發病率居于椎管疾病的第一位［2］。在英國每年約有三分之一的人受腰痛折磨［3］。但是目前關于腰椎間盤突出癥的發病機制尚未闡明，其臨床主要表現為腰痛、腿痛、神經功能障礙等癥狀［3-4］。中醫認為腰椎間盤突出癥屬于“筋病”、“腰痛”、“痹癥”的領域，最早見于《素問·脈要精微論》：“腰者腎之府，轉搖不能，腎將憊矣”，《素問·五常政大論》也有相關論述“濕氣下臨，腎氣上從，當其時反腰椎痛，動搖不便也”。

當歸四逆湯（Danggui-Sini Decoction，DSD）自于張仲景所著的《傷寒論》，其條文分別在辨厥陰病篇和附篇《辨不可下并脈證并治第二十》中記載。當歸四逆湯由當歸三兩、桂枝三兩(去皮)、芍藥二兩、甘草二兩(炙)、細辛三兩、通草二兩、大棗二十五枚(擘)組成，主要功效為溫通經脈、驅散內寒、調養精血［5］?，F代研究中當歸四逆湯具有治療糖尿病周圍神經病變、冠心病、消化性潰瘍、肩周炎、頸椎病、血栓閉塞性脈管炎、雷諾氏病、痹癥等疾病的功效［6-8］。臨床觀察顯示，當歸四逆湯對治療腰椎間盤突出癥有著明顯作用［9-12］。

網絡藥理學主要研究藥物作用靶點、功能及作用通路以推斷出藥物所能達到的理想療效和作用機理。中藥復方涉及多種藥物，通過藥物靶點之間的共同作用達到療效。網絡藥理學的給藥思路和中藥的復方給藥本質殊途同歸，利用網絡藥理學可以幫助了解當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的機制,并為腰椎間盤突出癥新療法的開發探索提供思路。

1 材料與方法

1.1 當歸四逆湯作用靶點的獲取

當歸四逆湯方由當歸、桂枝、白芍、甘草、細辛、通草、大棗七味藥物組成。通過檢索中藥系統藥理學技術平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP ；https://tcmspw.com/）和中藥潛在靶點數據庫（the petental target data base of traditional Chinese medicine，TCM-PTD ；http://tcm.zju.edu.cn/），找到當歸四逆湯的活性成分，并根據藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18的標準進行篩選，得到當歸四逆湯的有效活性成分。

在TCMSP中檢索有效活性成分相關靶點。將得到的當歸四逆湯作用靶點與UniProt（https://www.uniprot.org/）數據中的靶點名稱相匹配，得到作用靶點名簡稱。

1.2 腰椎間盤突出癥相關作用靶點獲取及篩選

人類基因GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/）能提供靶點、靶點與疾病的關系等多種信息。孟德爾疾病基因OMIM數據庫（https://omim.org/）含有已知的孟德爾疾病、15 000條基因信息和人類關注的表型和基因型之間的關系。在GenCards數據庫和OMIM數據庫中以“lumbar disc herniation”、“LDH”為關鍵詞檢索與腰椎間盤突出癥相關的疾病靶點，并除去重復數據。

1.3 當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點的獲取

為明確腰椎間盤突出癥疾病相關靶點與當歸四逆湯復方潛在靶點之間的相互作用關系，將腰椎間盤突出癥靶點與當歸四逆湯潛在靶點進行交集，以獲取藥物疾病共同作用靶點。利用 ClusterProfiler R 語言編程軟件繪制Venn圖，得到當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點。

1.4 藥物活性成分-靶蛋白-疾病共表達網絡的構建與分析

將當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點和活性成分與潛在作用靶點的關系輸入Cytoscape Version 3.6.1軟件，構建活性成分-靶點網絡。

1.5 蛋白-蛋白互作網絡的構建與分析

STRING平臺（https://string-db.org/，version11.0）是一種包含已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫，其中收集了大量的蛋白相互作用關系。將篩選得到的疾病-藥物成分共同靶蛋白導入STRING功能性蛋白質關聯網絡平臺，限定物種為人類，最低相互作用閾值設為高等“medium confidence”（Score≥0.4）獲取蛋白互作關系（protein-protein interaction，PPI）。使用Cytoscape 3.6.1軟件對獲得的PPI蛋白互作網絡進行拓撲分析。

將得到的蛋白互作關系表格使用ClusterProfiler R軟件進行分析注釋，對蛋白互作網絡中與其他靶點關聯性較強的靶點進行排序，得到核心靶點的信息。

1.6 基因本體論（GO）富集分析

為了闡明當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥潛在靶點在基因功能層面上發揮的作用，使用ClusterProfiler R軟件對當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，將結果可視化。

1.7 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

使用ClusterProfiler R軟件中BioConductor平臺的“clusterProfiler”功能對當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并將結果可視化。將結果導入Cytoscape Version 3.6.1軟件構建“活性成分-靶點-通路”網絡圖。

1.8 分子對接

采用AutoDock vina軟件對上述分析后得出的關鍵靶點及活性分子進行對接驗證。

2 結果與分析

2.1 當歸四逆湯活性成分和作用靶點的獲取

通過TCMSP、TCM-PTD檢索，OB≥30%、DL≥0.18進行篩選，得到細辛有效活性成分8個，通草有效活性成分4個，桂枝有效活性成分7個，甘草有效活性成分4個，當歸有效活性成分2個，大棗有效活性成分15個，白芍有效活性成分13個，去除重復的有效成分，得到當歸四逆湯的有效活性成分45個，詳見表1。

表1 當歸四逆湯的活性成分Tab.1 Active ingredients of Danggui-Sini Decoction

根據得到的有效活性成分，在TCMSP數據庫檢索得到細辛作用靶點164個，通草作用靶點6個，桂枝作用靶點74個，甘草作用靶點106個，當歸作用靶點69個，大棗作用靶點113個，白芍作用靶點123個，去除重復靶點，得到當歸四逆湯的作用靶點164個，與Uniprot數據庫中載入的靶點簡稱進行基因名稱匹配，最終得到當歸四逆湯的作用靶點132個，詳見表2?？梢姰敋w四逆湯的活性成分較多且復雜，具有較強的藥物利用價值，多靶點多通路共同作用于疾病。本文對當歸四逆湯作用靶點及活性成分進行整理，有助于相關試驗的進一步開展。

表2 （續）Tab.2 (continued)

表2 當歸四逆湯作用靶點Tab.2 Targets of DSD

2.2 腰椎間盤突出癥作用靶點的篩選

在GenCards數據庫和OMIM數據庫中以“lumbar disc herniation”、“LDH”為關鍵詞檢索與腰椎間盤突出癥相關的疾病靶點并除重復基因后，得到疾病作用靶點379個。

2.3 當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點的獲取

將當歸四逆湯的作用靶點和腰椎間盤突出癥的相關靶點輸入ClusterProfiler R軟件繪制Venn圖，左邊藍色代表腰椎間盤突出癥相關靶點，紅色代表當歸四逆湯藥物作用靶點，陰影部分表示兩者的共有靶點，見圖1。得到當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點25個，見表3。潛在作用靶點為我們研究的重點，可提示藥物治療疾病的關鍵信息。

表3 當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在靶點Tab.3 DSD acts as a potential target for lumbar disc herniation

圖1 當歸四逆湯-疾病共有靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the common targets between DSD and disease

2.4 構建藥物活性成分-靶蛋白-疾病共表達網絡

采用 Cytoscape 3.6.1軟件構建當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的活性成分-靶蛋白-疾病共表達網絡圖，其中當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥相關的有效活性成分有8種（藍色菱形代表），分別是paeoniflorin、beta-sitosterol、kaempferol、(+)-catechin、stigmasterol、formononetin、licochalcone a、sesamin，共同作用于25個共同靶點（綠色方形節點代表），見圖2。網絡圖顯示出當歸四逆湯發揮作用時呈現出多成分、多靶點的特點。且beta-sitosterol、kaempferol、sesamin連接靶點較多，可視為藥物作用的關鍵成分。

圖2 當歸四逆湯“活性成分-疾病靶蛋白”網絡圖Fig.2 The “drug active component-disease target” network of DSD

2.5 蛋白-蛋白互作網絡的構建與分析

將通過篩選獲取的疾病和藥物成分共同靶蛋白在STRING平臺構建蛋白-蛋白相互作用網絡PPI模型。將蛋白種類設置為人類，最低相互作用閾值設為中等“medium confidence”（0.4），其余值不做修正，獲取PPI蛋白互作網絡圖，見圖3。

圖3 當歸四逆湯與腰椎間盤突出癥蛋白-蛋白互作網絡Fig.3 The protein-protein interaction network of DSD and LDH

再應用 Cytoscape 3.6.1中的cytohHubba插件繪制靶蛋白-蛋白互作網絡拓撲分析圖，見圖4。圖中節點顏色隨著Degree值的增大而顏色加深，Degree平均值為14.64。結果提示：當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的靶標中Degree值從大到小排列，值較大的10個靶蛋白為IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、JUN、CASP3、MAPK14、IL10。具體結果見圖4。

圖4 蛋白-蛋白互作網絡拓撲分析圖Fig.4 Protein-protein interaction network topology analysis diagram

將蛋白互作關系使用ClusterProfiler R軟件進行分析注釋，根據相連靶點的數目（Count）進行排序，結果顯示，當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的靶標中Count值排名前十的靶蛋白為IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14，具體見圖5。PPI中Degree值可提示該靶點在網絡中聯系廣，信度高。Count值提示相連靶點數目較多，二者結合可得出當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的關鍵靶點：IL6、AKT1、MAPK1、MAPK14、STAT3、MAPK8、CASP3、IL10。

圖5 蛋白-蛋白互作網絡注釋分析Fig.5 Annotation analysis of protein-protein interaction network

表4 共同靶點的GO功能富集分析Tab.4 The GO analysis of co-target protein

2.6 GO功能富集分析

使用ClusterProfiler R軟件對當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的潛在作用靶點進GO功能富集分析，探究當歸四逆湯治療疾病的可能作用機制。設置物種為人類，P<0.05，共得到44條結果，其中包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活性、半胱氨酸型內肽酶（cysteine endopeptidases，CE）活性參與凋亡過程、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶（serine proteinases/ threonine/tyrosine kinase）活性、血紅素結合/核受體活性/轉錄因子活性、直接的配體調節序列特異性DNA結合、細胞因子受體結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、磷酸酶結合、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）結合等，見表5。并將結果用氣泡圖表示，橫坐標表示該通路富集的靶點數目占總數的比例，縱坐標為功能名稱，圓點大小表示富集的靶點數目多少，圓點越大則表明該功能上的靶點數目越多，圓圈的顏色表示調整后P值（Padjust）大小，由藍到紅調整后P值逐漸減小，詳見圖6。

圖6 共同靶點的GO功能富集分析（前20）Fig.6 The GO analysis of co-target protein（Top 20）

2.7 KEGG通路分析

使用 ClusterProfiler R軟件對當歸四逆湯與腰椎間盤突出癥的共同靶點進行KEGG通路富集分析，以調整后P值為篩選條件，篩選出作用通路共17條，包括缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、FoxO（forkhead box O3）信號通路、內分泌抵抗、鉑耐藥、鞘脂信號通路、MAPK信號通路、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑、ErbB（verb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog）信號通路、精氨酸生物合成、p53信號通路、環磷酸鳥苷酸-蛋白激酶 G（cGMP-PKG）信號通路、核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強（NF-κB）信號通路、Rap1信號通路、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、卵母細胞減數分裂、精氨酸和脯氨酸代謝、大鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）信號通路，具體見表5。繪制氣泡圖，縱坐標表示功能名稱，橫坐標為富集的靶點數目，顏色表示調整后P值，由藍到紅P值逐漸減小，見圖7。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

表5 KEGG通路富集分析Tab.5 KEGG pathway enrichment analysis

將所得通路輸入Cytoscape3.6.1，輸出“活性成分-靶點-通路”網絡圖，橢圓形表示通路，三角形表示活性成分，箭形表示靶點，關聯的節點數目越多則形狀越大，見圖8。

圖8 “活性成分-靶點-通路”網絡圖Fig.8 “Active ingredient-target-path” network diagram

2.8 分子對接

選取上述分析后得出的IL6和AKT1 2個關鍵靶蛋白進行對接驗證，見圖9、10。

圖9 IL6與paeoniflorin 分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of IL6 and paeoniflorin

IL6與paeoniflorin對接后顯示，paeoniflorin提供了4個氫鍵結合位點，分別為GLN156、ASP160、GLU106、SER107，氫鍵較多提示結合部位較為緊密。AKT1與kaempferol對接顯示，kaempferol提供了2個氫鍵結合位，分別是CYS310、TYR326，且根據3D全景圖可見，AKT1結合位點分裂為2個部分，結合結構相對較為復雜。

3 討論

腰椎間盤突出癥的患者病因相對復雜，現代研究認為發病機制主要包括腰椎間盤退行性改變、急性損傷、慢性勞損、炎癥化學刺激、自身免疫反應的作用等［13-16］。本研究采用網絡藥理學的方法研究當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的潛在靶點和作用機制。結果顯示，藥物含有25個潛在作用靶點。蛋白-蛋白互作網絡分析表明，IL6、AKT1、PTGS2、MAPK1、STAT3、MAPK8、MAPK14等靶點存在協同作用，提示該方劑在治療腰椎間盤突出癥中具有多組分、多靶點、多功能、多通路的復合型特點。白細胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是T細胞和巨噬細胞所衍生的趨化因子族群中的一種細胞因子，并作為重要的中樞基因參與相位反應的產生、調節身體免疫系統以及運動期間的新陳代謝等生物活動［17］。試驗研究對腰突和正常組織進行檢測后發現，IL6表達陽性細胞在突出腰椎間盤周圍的炎性肉芽組織中表達最強，因此IL6為腰椎間盤突出癥疼痛產生的關鍵因子［18］。本研究顯示，IL6與芍藥苷（paeoniflorin）存在相互作用關系，提示paeoniflorin可能為當歸四逆湯抑制腰椎間盤突出癥的關鍵化學成分。AKT1參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程。近年來的試驗研究表明AKT1在血管損傷中起著重要作用［19］。腰椎間盤壓迫刺激血管導致神經根局部供血障礙、炎性水腫和酸性代謝產物積聚，使神經根傳導功能下降，是腰椎間盤突出癥引發腰腿痛的主要原因［20］。FoxO1作為由AKT1調控的轉錄因子［21］，同時也是成骨細胞增殖和氧化還原平衡所需的唯一因子，可控制骨的形成。AKT1主要通過PI3K/AKT途徑使FoxO1磷酸化，失去調控成骨細胞生長的能力［22］。這與本研究證實FoxO信號通路為當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥關鍵信號通路的結論相吻合。AKT1與山萘酚（kaempferol）相互作用，并且通過PI3K/AKT途徑影響FoxO1治療腰椎間盤突出癥，這為腰椎間盤突出癥新藥的研究帶來新的啟示。

KEGG代謝通路富集分析和GO功能富集分析結果表明，當歸四逆湯治療主要通過MAP激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、血紅素結合、磷酸酶結合、氧化還原酶活性、FMN結合、內肽酶活性、激素結合等功能治療腰椎間盤突出癥，涉及 HIF-1、FoxO、NF-κB、MAPK、p35等信號通路。HIF-1的活性對于組織缺血后的恢復十分重要。HIF-1能夠通過上調與血管系統相關的蛋白基因表達，如使血管生成更多的內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體和誘導型一氧化氮合酶等來抑制缺血損傷［23］，同時通過與靶點VEGF、STAT3相關聯，在缺氧的條件下促進破骨細胞的產生［24］。NF-κB信號通路在損傷應答、炎癥反應及免疫調控等病理方面具有重要作用。動物試驗表明，抑制NF-κB信號通路可下調炎性因子的表達水平，從而達到緩解疼痛的作用［25-27］。有研究顯示，HIF-1可以通過抑制NF-κB信號通路使破骨細胞延遲分化或不分化，從而抑制破骨的吸收［28］。同時提示，STAT3可能與腰椎間盤突出癥中骨的吸收與再生相關，其相關活性成分甘草查爾酮a（licochalcone a）可為新藥的開發提供思路。MAPK通路同樣可以誘導各種促炎因子［29］，下調MAPK活性，抑制MAPK通路可以達到緩解炎癥的作用。最新研究表明，FoxO信號通路可以通過調節T細胞建立功能適應性免疫系統，以抵抗細胞損傷，能夠為藥物醫治腰椎間盤突出癥帶來新的提示［30］。

藥物成分-靶點-通路網絡分析結果顯示，當歸四逆湯活性成分中的山奈酚、β-谷甾醇（β-sitosterol）靶點數目最多，提示這些活性成分可能參與了當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥的過程。本研究結果表明，當歸四逆湯中山奈酚、β-谷甾醇等成分對IL6、AKT1、MAPK1、MAPK8、PTGS2、STAT3、CASP3、JUN、IL10、MAPK14等相關靶點通過HIF-1、FoxO、內分泌抵抗和MAPK等信號通路以抑制缺血損傷、下調炎性因子、構建免疫系統等功能作用于腰椎間盤突出癥。

綜上，本研究揭示了當歸四逆湯作用于腰椎間盤突出癥的靶點、通路及作用機制，利于臨床進行參考應用，同時為新藥開發提供思路。