普洱茶提取物對單純性肥胖大鼠MC4R基因表達的影響

易 娟，尹龍武，王 偉，彭鳳蘭

（長沙衛生職業學院，長沙 410000）

隨著社會經濟的迅速發展，人民的生活方式與膳食結構不斷發生改變，肥胖正以令人擔憂的速度逐年增加，日趨成為最嚴重的世界性健康問題之一。肥胖不僅被認為是2型糖尿病發生的重要危險因素，而且嚴重影響心血管疾病的發生。超重和肥胖的人患上癌癥的概率比普通人顯著增高［1］。減肥可降低血壓和血脂水平，減少2型糖尿病的發病率，減少各種慢性疾病和急性不良事件的發生。

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料，經過后發酵形成的，包括長時間自然發酵和人工渥堆發酵。普洱茶中的化學活性物質成分較綠茶等發生了較大變化，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等兒茶素含量低，而兒茶素等在發酵過程中轉化成大量高聚化合物——茶褐素［2］。普洱茶或茶褐素均具有改善肥胖、調節血脂等功效［3-6］。目前關于普洱茶抗肥胖的機制研究尚不明確。已有研究揭示其可能與調節脂肪細胞合成和分化相關基因、脂肪代謝相關酶活、抑制脂肪細胞增殖和分化以及脂肪組織分泌的細胞調節因子等有關，且近年來又發現茶多酚能通過調節腸道菌群來調節肥胖［6-8］。目前普洱茶抗肥胖作用與食欲和能量調控中樞的關系這個研究領域稀缺［8］。黑皮素受體-4（melanocortin4 receptor，MC4R）作為神經中樞重要調節因子之一，近年來備受關注［9］。MC4R激動劑、瘦素類似物和脂肪酶抑制劑等一起被評估為較有前途的治療和預防肥胖的新靶點，這些藥物可能起著“飽腹信號”或者“拮抗食欲信號”等作用，可通過增加脂肪利用或降低脂肪吸收等調節肥胖［10］。但是，目前國內外尚未見茶或茶多酚調節MC4R基因表達的相關報道。本研究旨在觀察普洱茶提取物對高脂飲食誘導肥胖大鼠MC4R的影響，進而探討普洱茶提取物抗肥胖的相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

普洱茶提取物的原材料來自云南紅河州哈尼古茶熟餅，由中南大學生命科學院茶與健康研究室分離提取，應用高效液相色譜法和分光光度法分析普洱茶提取物中兒茶素及茶多酚含量（表1）。

表1 普洱茶提取物中茶多酚和兒茶素類含量Tab.1 Contents of tea polyphenols and catechins in Pu-erh tea extract

1.2 動物試驗

30只雄性SD大鼠由湖南萊克斯景達實驗動物有限公司提供，體重90～100 g，隨機分為3組：正常對照組（ND組），高脂飼料組（HF組），普洱茶提取物干預組（PTE組）。正常對照組采用大鼠基礎飼料；高脂飼料組飼料是在基礎飼料中添加10.0%豬油、1.0%膽固醇、10.0%蔗糖、0.5%脫氧膽酸鈉等；普洱茶提取物干預組飼料是在2 g普洱茶提取物中均勻混合100 g高脂飼料制成的。定期檢測大鼠體重（2次/周）。于3個月時，禁食12 h后，采靜脈血，生化檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、血甘油三酯（triglyceride，TG）、血低密度脂蛋白（low density lipoprotein-C，LDL-C）及血高密度脂蛋白（high density lipoprotein-C，HDL-C）等各項血脂水平（測試盒分別來自南京建成A111-1、A112-1、A113-1、A110-1）。麻醉處死大鼠后，取腸系膜、附睪等脂肪組織稱重，并留取附睪脂肪組織冷凍于液氮下用于mRNA檢測。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測

1.3.1 組織樣品處理和RNA的提取

用液氮對干燥的研缽降溫；將附睪脂肪組織樣品放置于研缽內，研磨組織至粉末狀。按照組織量加入TRlzon Reagent（CWBIO CW0580S），提取總RNA。

1.3.2 逆轉錄及熒光定量PCR

將RNA通過逆轉錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液聚集到管底。將對應體積的dNTP Mix、Primer Mix、RNA Template混勻后，于70℃孵育10 min，再迅速冰浴2 min。再將對應體積的5×RT Buffer、DTT、HiFiScript混勻后，于50℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反應結束后，短暫離心，將其置于-80℃冰箱以防降解。利用逆轉錄聚合酶鏈反應分析肥胖相關基因MC4R的相對豐度。擴增程序：95℃預變性10 min，95℃ 變性10 s， 58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40次。相關基因的引物信息見表2。

表2 PCR引物信息Tab.2 Oligonucleotide sequences for primers

1.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

用液氮將研缽預冷，取0.2 g附睪脂肪組織放入研缽中充分研磨，加蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒（CW0014S，康為世紀）對總蛋白進行定量。加入無水乙醇壓膠，待分離膠凝固后，加入濃縮膠，配制1乘電泳液，電泳，60 V壓縮蛋白（30 min），80 V分離蛋白（120 min），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉膜（300 mA恒流，2 h），封閉，一抗孵育過夜，Tris-HCl 緩沖液（Tris-buffered Saline Tween，TBST）反復洗膜，二抗孵育2 h，TBST反復洗膜，加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯色后，進行凝膠顯影成像。利用蛋白質印跡法檢測大鼠脂肪組織中肥胖相關基因MC4R的蛋白表達。

1.5 統計分析

采用 SPSS 19.0軟件進行處理，試驗結果以平均數±標準差（±s）表示，組間顯著性差異為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 普洱茶提取物減肥降脂作用

2.1.1 普洱茶提取物對體重和體脂的影響

各組大鼠體重變化曲線如圖1所示，終末體重統計詳見表3。與正常對照組相比，高脂組大鼠的終末體重顯著增加，顯示高脂飲食誘導的單純性肥胖模型構建成功。普洱茶提取物干預組大鼠的終末體重與高脂組相比顯著下降（P<0.05），與正常對照組相比略高，但無統計學差異，表明普洱茶提取物能抑制高脂飲食誘導的大鼠體重增加。

表3 各組大鼠體重、脂肪組織重量以及體脂比Tab.3 Body weight, adipose tissue weight and body fat ratio

圖1 大鼠體重變化圖Fig.1 Body weight gain of rats

高脂組大鼠附睪脂肪組織、腹膜脂肪重量以及體脂比與正常對照組相比均明顯增加，由此可見高脂模型構建成功。普洱茶干預組大鼠附睪脂肪組織和腹膜脂肪重量以及體脂比，與高脂組相比顯著下降（P<0.05），與正常對照組相比無統計學差異。試驗表明，普洱茶提取物能抑制高脂飲食誘導的大鼠體脂增加。以往的試驗是多用茶水鼻飼法干預高脂肥胖大鼠，發現普洱茶具有減肥效應［11-12］。本試驗將普洱茶提取物混入高脂飼料進行喂養，證實不同的攝入方式同樣可以達到減肥降脂的作用［4，13］。

2.1.2 普洱茶提取物對血脂水平的影響

與正常對照組相比，高脂組血清中TG、TC、LDL-C均顯著升高（P<0.05），HDL-C顯著降低（P<0.05）（表4）。與高脂組相比，普洱茶提取物干預組血脂水平降低，其中TC降低了34.5%，LDL-C降低了44.7%，HDL-C升高了56.8%，TG降低但無統計學意義，可見普洱茶提取物能調節高脂飲食誘導的大鼠血脂水平。結果表明，與肥胖模型組比較，普洱茶提取物能有效地抑制肥胖大鼠TG、TC、LDL-C等生化指標，具有較好的降低血脂的作用［11-13］。

表4 生化檢測大鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C及TG含量Tab.4 Contents of TC, HDL-C, LDL-C and TG in rat serum unit: mmol·L–1

2.2 普洱茶提取物對肥胖因子MC4R mRNA和蛋白表達的影響

與正常對照組相比，高脂組MC4RmRNA和蛋白表達顯著下調，在普洱茶提取物干預組的表達卻顯著上調（P<0.05）。與高脂模型組相比，普洱茶提取物干預組脂肪組織中MC4RmRNA和蛋白的表達顯著上調（P<0.05）。可見普洱茶提取物能顯著上調飲食誘導肥胖大鼠中MC4RmRNA和蛋白的表達水平（圖2、3）。

圖2 普洱茶對高脂飲食導致肥胖大鼠中MC4R mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Pu-erh tea extracts on MC4R mRNA expression in adipose tissue of obesity rats induced by high-fat diet

3 討論

普洱茶在發酵過程中，茶多酚等化學物質轉化成一種高聚化合物——茶褐素，它是普洱茶重要的活性物質。有研究表明，普洱茶降血糖血脂等作用與其他茶類不同，可能與這種高聚化合物密切相關［5，10］。本試驗是將普洱茶提取物混入高脂飼料進行喂養，其能有效地抑制高脂飲食試驗動物的體重和脂肪組織，并能降低TG、TC、LDL-C等血脂水平，具有良好的減肥降脂作用［4，11-14］。區別于茶水鼻飼法干預高脂肥胖大鼠，本試驗發現不同的攝入方式同樣可以達到減肥降脂的作用。肥胖受多基因、多信號影響，有學者提出普洱茶減肥機制是否與中樞神經信號因子相關［8］。本文觀察了普洱茶對高脂飲食誘導的肥胖大鼠中MC4R的影響，從而探討普洱茶抗肥胖機制。

圖3 普洱茶對高脂飲食導致肥胖大鼠中MC4R蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Pu-erh tea extracts onMC4R protein expressions in adipose tissue of obesity rats induced by high-fat diet

近年來較多研究證實MC4R與肥胖的發生密切相關，在調節體重中起關鍵作用。作為重要的肥胖調節因子之一，MC4R是下丘腦分泌的一類肽類物質，能通過中樞神經調節體重，可抑制食物攝入，調節瘦素、胰島素、血糖等，從而減低體重調節體脂［9］。動物試驗表明，敲除MC4R基因的小鼠表現出攝食過多等肥胖綜合癥［14］，而人類MC4R基因突變能導致青少年肥胖癥［15］。英國劍橋大學的學者2019年在Cell期刊上發表一項研究，對來自英國生物庫（UK Biobank）中的50萬人中鑒定出的61種MC4R基因變異型進行了功能性描述，研究了它們與身體質量指數和肥胖相關心血管代謝疾病之間的關聯性，發現利用其中偏向β和arrestin招募的MC4R信號傳導可能成為治療肥胖及其相關心血管代謝疾病的有效策略［16］。下丘腦黑皮質素神經元的活性受到瘦素、饑餓激素、胰島素等這些外周激素的調節，這些外周信號分子可影響黑皮質素神經元活性而傳遞機體代謝信息［17］。2020年Ezzat等［18］發現，辣木籽提取物能控制高脂飲食肥胖大鼠血脂和體重，其降脂抗肥胖的作用機制與顯著上調MC4R和PPAR-α的mRNA基因（P< 0.01）表達有關。以往的高脂飲食動物試驗證實，普洱茶能顯著降低游離脂肪酸FFA合成基因，增加PPAR-α及Leptin等脂肪合成和分化相關基因的表達［13，19］。我們的研究發現，普洱茶提取物能使高脂飲食誘導組大鼠脂肪組織中MC4R顯著上調。可見普洱茶提取物對飲食導致的單純性肥胖的減肥機制與普洱茶提取物能調節MC4R，從而影響能量代謝神經中樞調節脂肪代謝平衡有關，其作用機制是否與介導PPAR-α及Leptin等脂肪相關信號通路有關聯，需要更多試驗深入研究。

普洱茶減肥降脂作用較為明顯，然而作用機制尚不明確。本文用RT-PCR及Western blot方法檢測觀察了普洱茶對與高脂飲食誘導的肥胖大鼠中MC4R基因的影響，結果表明普洱茶提取物能明顯上調高脂飲食誘導的肥胖大鼠中MC4R基因mRNA和蛋白表達水平。試驗結果提示，普洱茶減肥作用可能與中樞調節脂肪代謝平衡的重要因子MC4R有關。然而普洱茶活性物質復雜且不穩定，其機制是否與普洱茶中主要活性物質茶褐素有關，還需多方面多角度深入探討。此外，富含活性物質EGCG的綠茶和富含茶黃素的紅茶等其他茶類抗肥胖作用是否與調節MC4R有關，也值得更多的試驗探討。