53BP1缺失補償DNA同源重組修復增強BCCIP陰性乳腺癌細胞放療抗性

羅婉蓉，余 佳，劉 沖，金曉旎，歐陽鈺沭，童 星，劉寧昂*

（1.蘇州大學醫學部放射醫學與防護學院，放射醫學與輻射防護國家重點實驗室，江蘇省高校放射醫學協同創新中心，蘇州 215123；2.蘇州大學醫學部實驗中心，蘇州 215123）

20世紀70年代末以來，全球乳腺癌發病率一直呈上升趨勢。2018年，預計全國約有36.8萬新發乳腺癌病例，乳腺癌已成為45歲以下女性最常見的癌癥死因［1］。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）三種受體均呈陰性表達的乳腺癌亞型。中國女性TNBC患者占所有乳腺癌的12%～20%，遠高于西方國家10%～15%的占比［2-3］。與激素受體（ER、PR）陽性或HER2陽性乳腺癌相比，由于分子特征的限制，TNBC缺少相關的內分泌和靶向治療靶點，導致其高復發率和高死亡率，且放療后TNBC的局部復發率遠高于其他乳腺癌亞型［4-5］。這提示TNBC存在固有的和/或獲得性的放療抗性，可能是導致TNBC放療失敗的重要原因。已有研究表明，約50%的TNBC與乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）及抑癌基因p53的突變或缺失相關［6-8］。然而，對于另外50%與BRCA1及p53缺陷不相關的TNBC亞型，其輻射抗性比BRCA1/p53缺陷型TNBC更高，且發病的分子機制尚不清楚［9-10］。因此，探明這一部分非BRCA1相關的TNBC輻射抗性的分子機制，是降低TNBC的輻射抗性和改善放療預后的關鍵。

輻射誘導的DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是細胞死亡的重要原因。因此，細胞內DSB的修復能力是決定其輻射敏感性、基因組完整性和細胞存亡命運的關鍵。抑制DSB的精準修復能增加腫瘤細胞對輻射的敏感性，而細胞內過高的DSB修復活性則導致腫瘤細胞輻射抗性的增強。真核細胞主要通過兩種修復方式應對DSB損傷：其一是修復精確性較低的非同源重組末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）；其二是修復精確度極高的同源重組修復（homologous recombination，HR）。兩種DSB修復途徑的選擇被細胞嚴格調控。以DSB修復相關的分子為靶標，通過對DSB修復通路的干預，選擇性抑制高修復精確度的同源重組修復活性，增加DNA輻射損傷修復錯誤率，有可能降低細胞的輻射抗性，從而改善放療的療效及預后。

本研究的前期研究中，特異性敲除小鼠乳腺上皮細胞中的DNA同源重組修復相關蛋白（BRCA2 and CDKN1A interacting protein，BCCIP）后，約50%的雌鼠快速形成了乳腺結節，其中10%最終發展成乳腺癌，并且所有BCCIP缺陷的乳腺癌細胞都喪失了DSB修復關鍵蛋白53BP1［11］。在乳腺癌病人的病理組織樣本中，約49%的TNBC中出現了BCCIP的自發缺失，同時53BP1的缺失和BCCIP陰性型TNBC呈高度相關［11］。根據上述研究的結果，本研究提出，53BP1的缺失提高了BCCIP陰性腫瘤細胞的輻射抗性。因此，基于前期大量的臨床、動物試驗數據及文獻調研證據，本研究通過闡明BCCIP/53BP1途徑對乳腺癌細胞輻射敏感性的調控機制，明確了約50%高輻射抗性TNBC的分子特征，為優化這類乳腺癌的治療方案、發現新的放療增敏靶點提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

小鼠乳腺癌4T1細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）為本實驗室構建；DR-GFP U2OS（人骨肉瘤細胞）由深圳大學許興智教授提供；人TNBC細胞MDA-MB-231由蘇州大學暢磊教授提供；RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培養基、DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibico公司；胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗和左旋谷氨酰胺購自江蘇海門碧云天生物技術有限公司；著絲粒和端粒熒光探針購自韓國Panagene公司；γH2AX抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；53BP1和Lamin B抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH抗體購自蘇州睿瀛生物技術有限公司；BCCIP抗體、Lipofectamine 3000轉染試劑及siRNA（si53BP1）購自美國Thermofisher公司。

1.2 細胞培養及BCCIP穩定敲低細胞株的構建

4T1 細胞培養于含有10% FBS、1% 雙抗及1%左旋谷氨酰胺的RPMI-1640培養基中，MEF、DRGFP U2OS和MDA-MB-231細胞均培養在含有上述相同添加成分的DMEM培養基中。細胞在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中常規培養，用0.25%的胰酶消化傳代。試驗所用細胞處于對數生長期。使用慢病毒載體plKD-CMV-Puro-U6-shRNA，插入文獻已報道的小鼠BCCIP shRNA回文序列（5'-GGATGAAGATGAGATCTTTGGTTCAAGAGACCAAAGATCTCATCTTCATCCTTTTTT-3'）［12］。配合psPAX2和pMD2.G輔助質粒轉染人腎上皮細胞293T細胞包裝病毒，并利用成熟的病毒感染細胞3次，以過表達shBCCIP序列構建BCCIP穩定敲低的細胞株。

1.3 細胞轉染

當細胞生長至60%～80%匯合度時，使用Lipofectamine 3000轉染試劑對DR-GFP U2OS細胞進行si53BP1的轉染。每105個細胞使用20 pmol siRNA。4T1、MEF和MDA-MB-231細胞用胰酶處理后混入si53BP1，使用Lonza Amaxa Nucleofector II電穿孔儀protocol T-24預先設定的電壓和脈沖頻率進行轉染。上述細胞轉染48 h后收獲，用于蛋白質印運（Western blot）檢測或后續試驗。本研究的試驗分組如下表1。

表1 本研究試驗分組Tab.1 The experimental groups in this study

1.4 Western blot檢測

除去細胞培養皿中的培養基，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗細胞2遍，徹底去除PBS后，加入適量十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）細胞裂解液，冰上裂解后收集蛋白。蛋白液經超聲破碎后，100℃變性5 min，渦旋混勻后上樣。分別使用12%和5%～6%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對γH2AX和53BP1進行檢測，電泳完成后進行轉膜。轉印有蛋白的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，經5%脫脂牛奶室溫封閉2.0 h。隨后，將封閉好的PVDF膜與γH2AX、BCCIP、53BP1或GAPDH等一抗在4℃條件下分別過夜孵育。第二天用PBST洗膜3次，每次10 min。室溫孵育相應種屬的二抗1.5 h，PBST洗膜后，用ECL（electrochemiluminescence）化學發光試劑在顯影機（Proteinsimple，FluorChem M）上檢測目的蛋白質條帶信號。

1.5 免疫熒光染色

細胞于照射后的不同時間經4.00%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）/PBS室溫固定10 min，用0.50% SDS和0.25% Triton X-100/PBS室溫通透5 min。隨后，經1.00%小牛血清（bull serum albumin，BSA）/PBS室溫封閉1 h，將樣品置于濕盒內，在4℃條件下過夜孵育一抗。次日清洗PBS后用對應的熒光二抗室溫孵育1.0 h。最后，經4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色并封片，在熒光顯微鏡下觀察結果。每組獨立試驗至少分析200個細胞的焦點數，試驗重復3次。

1.6 輻射類型及劑量

根據不同試驗的需要，利用X射線儀（RS 2000X-ray Biological Irradiator，Rad Source Technologies）對細胞進行0、2、4、6 Gy劑量的 X 射線照射，劑量率為1.046 Gy/min。在細胞受照后不同時間點收集樣品進行后續分析。

1.7 克隆形成試驗

首先，利用野生型細胞測試不同劑量下的克隆形成率。將充分分散的細胞按照推算的克隆形成率接種于60 mm培養皿中，12 h后進行照射處理，每處理組設置3個平行樣品以增加試驗可靠性。照射14 d后，顯微鏡下觀察每個克隆集落中的細胞數，當細胞數多于50個時，用甲醇固定細胞，并用結晶紫對細胞克隆進行染色，回收結晶紫溶液并清洗培養皿。待干燥后，計算細胞存活分數（surviving fraction，SF），繪制存活曲線，計算半數致死劑量（median lethal dose，LD50）。

1.8 端粒-著絲粒熒光原位雜交(CT-FISH）和姐妹染色單體（SCE）互換試驗

端粒-著絲粒熒光原位雜交（telomere-centromere fluorescencein situhybridization，CT-FISH）試驗：細胞經過2 Gy照射之后，立即加入0.025 μg/mL秋水仙堿，并在37℃培養 24 h以截獲輻射損傷修復后的中期染色體。胰蛋白酶消化并收集細胞，使用0.075 mol/L的氯化鉀低滲處理細胞使染色體松弛，隨后采用經典的Carnoy固定液［V（CH3OH）∶V（CH3COOH）=3∶1］4℃固定細胞3次。在染色體鋪片完成后，染色體與FITC-telomere PNA（peptide nucleic acid）探針和Cy3-centromere PNA探針（Panagene，South Korea）的混合雜交液在80℃高溫下變性3 min，并室溫雜交1 h，標記染色體的著絲粒和端粒，最后用DAPI標記染色體，完成CT-FISH的制片。

姐妹染色單體互換（sister chromatid exchange，SCE）試驗：向細胞中加入BrdU（終濃度為10 μmol/L），并于24 h后給與細胞2 Gy照射，照射后立即加入0.025 μg/mL秋水仙堿，37℃繼續培養24 h以截獲輻射損傷修復后的中期染色體。胰蛋白酶消化并收集細胞后，使用0.075 mol/L的氯化鉀低滲處理細胞使染色體松弛。隨后，采用經典的 Carnoy 固定液［V（CH3OH）∶V（CH3COOH）=3∶1］4℃固定細胞 3次。在染色體鋪片完成后，加入Hoechst 33258并在60℃條件下經black light曝光處理1 h。最后，用DAPI標記染色體，完成SCE制片。

上述制作好的玻片使用中期染色體自動捕獲細胞遺傳學工作站（MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2）進行PNA 探針標記的染色體和SCE染色體的高通量自動識別和圖像拍攝。使用Isis（MetaSystems）軟件對染色體進行快速分析。

1.9 數據處理與統計

每組試驗至少重復3次，數據以平均值±標準差表示。使用t檢驗進行統計學分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 高通量染色體快速精確分析系統的建立

基于中期染色體自動捕獲細胞遺傳學工作站（MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2）的軟件和硬件平臺（圖1a），首先建立了采用 CT-FISH 技術的染色體快速精確分析系統。相對于傳統的吉姆薩（Giemsa）染色，CT-FISH分析可以更加清楚直觀地展現染色體的端粒和著絲粒（圖1b），為精確分析不同類型的染色體畸變（圖1c，雙著絲粒染色體、三/四著絲粒染色體、片段、著絲粒環等），評價電離輻射后DSB的修復效率、基因組穩定性維持的能力等提供了優良的技術平臺。

圖1 中期染色體自動捕獲MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2細胞遺傳學工作站及CT-FISH對比吉姆薩染色在染色體分析中的優勢Fig.1 The advantages of metaphase chromosome automatical capture cytogenetics workstation established by MetaSystems/Zeiss Axio Imager Z2 and CT-FISH technique in chromosome aberration analysis compared to Giemsa staining approach

2.2 53BP1缺失增加BCCIP陰性乳腺癌細胞輻射后基因組穩定性

為明確53BP1的同時缺失是否提高了BCCIP陰性乳腺癌細胞對輻射基因毒性損傷的抵抗能力，本研究在驗證了53BP1和BCCIP的敲低效率后（圖2a），首先應用高通量染色體快速精確分析系統檢測53BP1缺失對BCCIP陰性4T1乳腺癌細胞電離輻射導致異常染色體形成率的影響，鑒定53BP1對輻射損傷后BCCIP陰性細胞基因組穩定性維持能力的調節作用。分析結果顯示，BCCIP的單獨缺失導致輻射后三著絲粒染色體畸變率的顯著增加（圖2b），這一結果與之前報道的BCCIP參與同源重組修復相符合［12］。而53BP1在BCCIP陰性4T1乳腺癌細胞中的額外缺失可以下調BCCIP缺陷導致的輻射后染色體高畸變率（圖2b），提示53BP1的額外缺失增加了輻射后細胞基因組穩定性的維持功能，部分恢復了BCCIP陰性細胞對輻射遺傳毒性的抵抗能力。

圖2 53BP1缺失可部分恢復BCCIP陰性細胞對輻射遺傳毒性的抵抗Fig.2 The defected resistant capacity to radiation genotoxicity in BCCIP deficient cells can be partially restored by 53BP1 additionally deletion

2.3 53BP1敲低促進BCCIP陰性乳腺癌細胞中輻射誘導DNA雙鏈斷裂的修復能效

輻射可以引起細胞基因組DNA多種類型的損傷，其中DSB是最為嚴重且致命的DNA損傷類型。第139位絲氨酸磷酸化修飾后的組蛋白H2AX被稱之為γH2AX，是公認的DNA雙鏈斷裂標志物，而輻射后γH2AX焦點的聚集形成被認為是細胞識別DSB并做出反應的關鍵步驟。根據細胞種類的不同，γH2AX水平一般在細胞受照0.5～2.0 h之間達到峰值，隨后由于細胞DNA修復程序的啟動而逐漸降低，約在受照8.0～24.0 h之間基本完成主要的DSB修復工作。因此，應用2 Gy X射線照射4T1細胞和MEF細胞誘導DSB損傷，并在照射后4.0 h固定細胞，通過免疫熒光染色分析γH2AX 焦點數量可以作為細胞DSB修復效率的評價依據。結果顯示，未照射的BCCIP和53BP1陽性的野生型細胞幾乎沒有γH2AX焦點形成，而BCCIP單缺失細胞則存在自發DSB損傷水平的升高（無統計學差異）。另外，與野生型細胞相比較，BCCIP陰性細胞經2 Gy劑量照射后，γH2AX 焦點數在照射后4.0 h依然保持較高水平，而53BP1的額外缺失可以明顯降低BCCIP陰性細胞中的γH2AX 焦點數量（圖3a）。這些結果提示，53BP1的同時缺失可以促進BCCIP陰性乳腺癌細胞受照后的DSB損傷修復能力。另外，我們在 BCCIP 敲低的MEF細胞中抑制53BP1表達，利用Western blot發現，細胞在4 Gy X射線照射8.0 h后γH2AX水平較BCCIP 單缺失組變弱，更接近正常對照組損傷修復后的恢復水平，提示53BP1缺失可以改善輻射后BCCIP陰性細胞中DSB的修復效率（圖3b）。與以往文獻報道相符，BCCIP單缺失組因同源重組修復效率的明顯抑制，自發及誘發DSB均無法得到有效修復，因而使細胞維持較高的γH2AX活化狀態（圖3）。

圖3 53BP1缺失促進BCCIP陰性乳腺癌細胞DSB修復效率Fig.3 The DSB repair efficiency in BCCIP negatively expressed breast cancer cells was enhanced by 53BP1 concurrent deletion

2.4 53BP1調控BCCIP低表達細胞同源重組修復及細胞輻射抗性

DR-GFP系統是利用細胞的同源重組修復，以特定序列為模板，將被I-SceI內切酶破壞的不完整GFP序列修復成具有表達活性的完整GFP熒光蛋白，從而通過熒光信息的表達情況報告細胞同源重組修復的效率。我們在DR-GFP U2OS細胞中同時敲低 BCCIP 與 53BP1，并轉入I-SceI內切酶表達質粒pCBAS，在GFP序列產生特異性的DSB位點，隨后利用流式細胞儀分析經同源重組修復后GFP熒光陽性細胞的比例。如圖4a所示，與BCCIP/53BP1陽性的DR-GFP U2OS細胞相比，BCCIP單敲低導致GFP信號的明顯降低，而53BP1在BCCIP敲低細胞中的同時缺失則顯著恢復了GFP熒光信號，提示53BP1的缺失可以恢復BCCIP陰性細胞的同源重組修復效率。

由于同源重組修復是介導DSB損傷后姐妹染色單體互換的重要途徑，因此姐妹染色單體的互換率也被廣泛作為評價同源重組修復效率的指標。利用Metasystem高通量染色體快速精確分析系統檢測姐妹染色單體互換率，得出與DR-GFP試驗相似的結果，53BP1缺失可以顯著補償輻射損傷后BCCIP敲低造成的同源重組修復效率的抑制（圖4b）。

圖4 53BP1缺失恢復BCCIP陰性細胞同源重組修復效率Fig.4 53BP1 depletion restored homologous recombination repair efficiency in BCCIP deficient cells

2.5 53BP1缺失增強BCCIP低表達乳腺癌細胞的輻射抗性

克隆形成是放射生物學中最為經典的細胞輻射敏感性檢測和評價指標之一。通過克隆形成試驗在BRCA1正常型人TNBC細胞MDA-MB-231中發現，不同劑量照射后，同時敲低BCCIP和53BP1的細胞克隆形成率較 BCCIP 單缺失的細胞恢復明顯（圖5），提示 53BP1缺失增強了BCCIP陰性乳腺癌細胞的輻射抗性。

圖5 克隆形成試驗Fig.5 Colony formation assay

3 討論

同源重組修復相關蛋白BCCIP于2000—2001年由兩個獨立的實驗室發現，因其與同源重組修復關鍵蛋白乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）相互作用而得名［13-14］。研究表明，BCCIP通過影響同源重組修復效率，在腫瘤細胞輻射敏感性的調節及基因組穩定性的維持中發揮重要作用。BCCIP在神經膠質瘤、喉癌、卵巢癌、結直腸癌、腎癌、肝癌等腫瘤組織中的表達量均下降或不表達［14-19］，提示BCCIP的缺失與多種實體瘤的發生相關。例如：在喉癌組織中p53表達正常，而 BCCIP缺失的病人具有較高的輻射抗性、局部復發率以及較低的生存率［16］。我們前期通過臨床研究也發現，在BRCA1及p53正常的高輻射抗性TNBC中，BCCIP的表達量顯著降低［11］。在473例乳腺癌病人活檢樣本中，有33%的樣本組織檢測出BCCIP表達的下調或缺失。在TNBC中，BCCIP的缺失率高達約49%，而非三陰性乳腺癌中BCCIP的缺失率僅為25%（P=3.86×10–7）。這些研究結果提示，BCCIP的表達缺失是BRCA1/p53正常型TNBC的一個重要分子特征，有可能是導致TNBC高輻射抗性的主要分子事件。

在細胞水平，BCCIP的缺失主要通過影響同源重組修復中的關鍵蛋白RAD51和BRCA2的功能，降低同源重組修復的效率而導致基因組不穩定，從而增加癌變風險［20-23］。與此同時，BCCIP缺失還會引起細胞對輻射的敏感性增加［24］。一個有趣的現象是，在正常細胞中，下調BCCIP蛋白會導致輻射敏感性增加，但BCCIP缺陷的腫瘤細胞卻表現出高輻射抗性。為了解釋這一現象，我們在前期研究中發現，約50%的組織特異性BCCIP敲低雌鼠在1年內快速形成了良性的乳腺結節，其中10%最終發展成了惡性乳腺癌［11］。更重要的是，所有BCCIP缺陷的惡性乳腺癌細胞都喪失了DNA損傷修復的一個關鍵蛋白——53BP1。與此同時，我們還發現，在TNBC病人的組織樣本中，53BP1的缺失和BCCIP陰性腫瘤呈高度相關。根據這些臨床病例研究和小鼠試驗的結果，我們推測53BP1的缺失很可能提高了BCCIP陰性腫瘤細胞的輻射抗性。

接下來的問題是，53BP1缺失通過何種途徑才能提高BCCIP陰性腫瘤細胞的輻射抗性？已知對DSB斷裂位點3'末端局部切除修飾啟動的調控在DSB修復通路的選擇中起決定性作用。同源重組修復需要核酸酶在斷裂末端切除修飾形成一個200 bp左右的單鏈同源臂。細胞周期嚴格調控的某些同源重組修復早期啟動因子，如BRCA1、BLM（bloom syndrome protein）、Exo1（exonuclease 1）等，在DSB末端切除過程中發揮重要作用。在非同源重組末端連接中這類末端切除修飾則被抑制，DSB修復關鍵調控蛋白53BP1在DSB位點的迅速聚集保護其末端免于過度切除，從而決定細胞DSB損傷的修復方式，并參與調節不同DSB修復途徑在細胞周期各時相中的優勢選擇［25-28］。病理情況下，同源重組修復相關蛋白的失活將導致細胞自發基因突變率的升高、基因組穩定性的降低，從而促進腫瘤發生率的升高。近年來，聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑由于對多種同源重組修復缺陷型腫瘤具有較好的治療效果，因而被美國食品及藥物管理局（food and drug administration，FDA）批準，并已廣泛應用于BRCA1缺陷型乳腺癌。然而已有臨床和基礎研究報道提示，部分BRCA1缺陷型三陰性乳腺癌對PARP抑制劑具有較高的耐藥性，其機理可能與53BP1的協同缺失及其引起的同源重組修復能效恢復有關［29-30］。如圖6所示，當53BP1和BRCA1（或BLM、Exo1等）功能均正常時，細胞中的BRCA1會識別DSB位點并抑制53BP1與其結合，促進DSB末端切除復合體（DNA end resection complex，ERC）等功能蛋白對受損DNA末端的識別和切除，從而啟動同源重組修復。如果同源重組早期啟動因子缺失，而53BP1正常表達，由于53BP1對DSB末端切除功能的抑制，同源重組修復缺少必要的啟動條件，DSB將主要通過非同源重組末端連接途徑進行易錯修復，導致輻射敏感性和基因組不穩定性的增加，細胞死亡。如果同源重組修復早期啟動因子和53BP1同時缺失，由于53BP1抑制作用解除，同源重組修復功能得到補償，細胞對輻射的抗性也隨之增強［28-30］。巧合的是，我們在前期工作中發現，53BP1的缺失還與BCCIP陰性的TNBC高度相關［11］。因此我們提出假設，53BP1缺失通過補償BCCIP缺陷造成的同源重組修復效能降低來維持基因組的穩定性，從而提高細胞的輻射抗性。

圖6 BRCA1和53BP1共同缺失導致部分恢復輻射引起的同源重組修復［7］Fig.6 Co-deficiency of BRCA1 and 53BP1 resulted in restoration of homologous recombination repair［7］

為驗證這一假說，本研究在小鼠乳腺癌等多種細胞中首先構建穩定敲低BCCIP的細胞株，在此基礎上通過siRNA敲低53BP1，構建BCCIP/53BP1雙缺失細胞。通過PNA熒光探針FISH技術聯合高通量自動捕獲系統對輻射誘導染色體畸變進行大規模分析，結果表明，敲低BCCIP引起細胞輻射后染色體畸變率的顯著增加，這一結果與先前的文獻報道相符［12］。而53BP1的額外缺失則降低了BCCIP陰性乳腺癌細胞染色體高畸變率的發生，從而增加輻射后細胞基因組穩定性的維持能力。隨后，通過對輻射后DSB損傷標志物γH2AX的檢測發現，53BP1的缺失促進了BCCIP陰性乳腺癌細胞DSB修復能力。進一步利用兩種不同的DSB修復檢測方法均發現，53BP1缺失通過補償BCCIP陰性細胞的同源重組修復效率，進而提高細胞應對DSB損傷的能力。最后，通過克隆形成試驗證實了53BP1的缺失增強了BCCIP陰性細胞的輻射抗性。這些結果提示，BCCIP/53BP1雙缺失型TNBC的高輻射抗性可能通過丟失53BP1使BCCIP陰性細胞解除對同源重組修復的抑制，進而增加BCCIP陰性乳腺癌細胞同源重組修復的效率，最終增強了細胞的放療抗性。

綜上所述，本研究從BCCIP/53BP1這條新途徑闡明TNBC高輻射抗性的原因，明確了BCCIP/53BP1雙缺失乳腺癌細胞高放療抗性是通過53BP1的缺失增強了BCCIP陰性細胞DSB損傷的同源重組修復能力。目前已報道的BRCA1/p53途徑只能解釋約50% TNBC輻射敏感性的調節機制，而本研究的發現說明了另外50% TNBC輻射抗性更強的原因，從而為全面闡明TNBC高輻射抗性的分子機制，尋找新的潛在放療增敏分子靶標，提供了理論基礎和試驗依據。