斑馬魚myo7ab基因敲除品系的構建

謝繽靈，鄧慧玲，付貴芳，王金福，謝鼎華，謝華平，3*

（1.湖南師范大學動物腸道功能調控湖南省重點實驗室，長沙 410081；2.湖南師范大學動物營養與人體健康實驗室，長沙 410081；3.湖南師范大學淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，長沙 410081；4.中南大學湘雅二醫院耳鼻咽喉科，長沙 410011；5.浙江大學生命科學學院細胞與發育生物學研究所，杭州 310058）

MYO7A是人類Usher綜合征1B型（Usher syndrome type 1B，USH1B）的致病基因。由人類MYO7A突變導致的Usher綜合征病例占Usher綜合征1型（Usher syndrome type 1，USH1）病例的29%～55%［1-2］。MYO7A基因編碼一種非傳統的肌球蛋白——MYOⅦA。該蛋白由2 215個氨基酸組成，包含1個N端運動結構域，1個含有幾個IQ基序的頸部區域，1個短的預測線圈結構域，1個MyTH4結構域，1個FERM_M結構域，1個SH3結構域，以及2個C端MyTH4-FERM串聯結構域［3-4］。MYOⅦA是一種Mg2+介導的ATP酶運動蛋白，它沿肌動蛋白絲運動，以Ca2+敏感的方式結合鈣調蛋白，在多種感覺毛細胞中都有表達，并參與多種細胞活動過程［5］。MYOⅦA在視網膜光感受器、視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）及內耳毛細胞中都有表達，主要參與光感受器中視蛋白轉運、RPE中黑色素小體運動，以及毛細胞中膜結合元件的錨定和保持，在胚胎早期內耳及視網膜的發育以及胚胎后期的整體發育中都至關重要［6-8］。人類MYO7A基因突變可導致常染色體隱性遺傳的USH1B，其特征是先天性感音神經性耳聾、前庭功能障礙及進行性視力喪失［9］。

內耳是人體重要的感覺器官，且聽覺感受器和位覺感受器都位于內耳。斑馬魚的聽覺器官包括內耳、韋伯氏器及側線系統。斑馬魚內耳主要由半規管和耳石器官構成，耳石器官中存在大量內耳毛細胞。內耳毛細胞是一種特化的上皮細胞，頂端具有纖毛束，可感受聲波刺激。當纖毛束結構遭到破壞時，聽力將受到影響［10］。Myo7a基因敲除小鼠品系的纖毛束發育異常，野生型纖毛束呈有序V型排列，而Myo7a–/–小鼠纖毛束分布雜亂無章［11］。斑馬魚作為模式生物，其內耳結構與人體存在一定差異，但由于其胚胎在體外發育，有利于觀察內耳發育過程，被廣泛應用于內耳發育和疾病模型的研究［12］。

斑馬魚的視網膜結構復雜精密，有多種神經元分層排布。其中感光細胞層由感光細胞——視桿細胞及視錐細胞構成。視桿細胞主要感受弱光刺激，含有視紫紅質；視錐細胞主要感受強光刺激。根據視蛋白的差別，斑馬魚視錐細胞可分為紅、綠、藍及紫外敏感型4種類型。感光細胞可將光信號轉變為電信號，該過程依賴于膜內外Ca2+濃度變化。斑馬魚與人均為晝行性動物，其視網膜結構非常相似，但斑馬魚視網膜層次結構更為簡單，雖然視錐細胞多一種紫外敏感型類型，但對視網膜表型分析及研究并無影響［10，13］。

在斑馬魚中，myo7a基因具有兩個不同拷貝——myo7aa和myo7ab。目前關于斑馬魚myo7aa基因的功能已有文獻報導，但對于myo7ab并無關注。為了研究myo7ab基因在斑馬魚內耳發育過程中的作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建斑馬魚myo7ab基因敲除品系［14］，這對于Usher綜合癥的病理機制的理解和新的防治方案的研發具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

TU斑馬魚品系來自國家斑馬魚資源中心，并由本實驗室養殖。水溫28.0℃，pH值6.5～7.5，14 h光照/10 h黑暗交替循環。1對斑馬魚1周產1次卵，胚胎在恒溫28.5℃的E3水（5.00 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.33 mmol/L MgSO4，0.10%甲基藍）［10］中培養，第5天開始喂食草履蟲至2周左右，之后轉移至養殖系統架上喂食豐年蟲。

1.1.2 主要試劑

引物由擎科生物技術有限公司合成；PCR高保真酶購自擎科生物技術有限公司（Cat#：TSE005）；DNA marker購自擎科生物技術有限公司（Cat#：TSJ012）；瓊脂糖購自擎科生物技術有限公司（Cat#：TSJ001）；PCR產物純化試劑盒購自生工生物工程股份有限公司（Cat#：B518131）；T7體外轉錄試劑盒購自invitrogen公司（Cat#：Am1314）；RNA純化試劑盒購自Qiagen公司（Cat#：74104）；Cas9蛋白購自invitrogen公司（Cat#：A36498）。

1.2 試驗方法

1.2.1 向導RNA（gRNA）靶位點設計

首先，在Ensembl網站（http://www.ensembl.org/index.html）上獲取目標基因的完整基因組序列（ENSDARG00000044632）、各個轉錄本以及內外顯子等信息；找出所有緊鄰5'-NGG-3'（protospacer adjacent motif，PAM）的候選靶序列，靶序列一般大小為18～20 bp。gRNA引物序列F基本結構：靶序列前加保護堿基（gcg）和T7啟動子（TAATACGACTCACTATA），靶序列后加gRNA骨架序列上游序列（GTTTTAGAGGCTAGAAATAGG）。gRNA-R序列：AAGCACCGACTCGGTGCCACT［14］。根據myo7ab基因靶位點，通過Primer3.0設計基因組正反檢測引物Gmyo7ab-F和Gmyo7ab-R（表1）。

表1 本文涉及到的引物和模板序列Tab.1 Primers and template sequences involved in this study

1.2.2 gRNA的合成

以Template DNA為模板（表1），gRNA1-F/gRNA-R或gRNA2-F/gRNA-R為正反引物，退火溫度為61℃，延伸時間為10 s，用高保真酶進行PCR擴增，獲得攜帶T7啟動子的myo7ab基因靶位點序列1及序列2的gRNA模板序列；PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收，以回收的PCR產物作為模板，用T7體外轉錄試劑盒合成gRNA，轉錄產物用RNA純化試劑盒進行純化回收，–80℃保存。

1.2.3 顯微注射以及靶位點有效性檢測

收集15 min內產的斑馬魚受精卵，待發育至1細胞期，將myo7ab基因靶位點的gRNA1、gRNA2和Cas9蛋白混勻（終質量濃度分別為25.00、25.00、2.33 μg/μL）注射到斑馬魚受精卵中，每顆胚胎的注射體積控制為1 nL，隨后置于28.5℃的恒溫箱中培養；受精卵發育至36 h后挑選部分胚胎進行基因敲除的有效性鑒定，剩余胚胎繼續培養至成魚。

1.2.4 可穩定遺傳突變體的篩選

將注射后的胚胎培養2個月至發育為幼魚，對幼魚逐條剪尾并進行基因型鑒定。由于兩個靶位點之間相距96 bp，如果兩個靶位點都有效，就會造成較大片段的缺失。用檢測引物對基因組進行PCR擴增，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳。根據真核生物的DNA損傷修復機制，由于目標敲除條帶大小未知，若PCR產物同時出現465 bp的野生型目的條帶，以及比野生型目的條帶小的條帶，則這些幼魚為攜帶突變的F0代魚；將F0代幼魚繼續飼養1個月左右至成魚，與野生型進行雜交，用同樣的基因型鑒定方法篩選出可穩定遺傳的魚，這些魚為F1代突變體。基因型鑒定后，將F1代突變體中比野生型目的條帶小的條帶進行切膠回收，并送公司測序，分析突變位點和堿基數目。

2 結果與分析

2.1 myo7ab基因結構域分析

首先在NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上查找斑馬魚myo7ab基因的序列并將其下載，利用SMART網站（http://smart.embl-heidelberg.de）查找其蛋白結構域（圖1）。

圖1 MYO7AB蛋白結構域分析Fig.1 Analysis of MYO7AB protein domain

2.2 myo7ab基因靶位點確定

按1.2.1所述的方法在myo7ab基因編碼MYSc蛋白結構域的序列區域選擇基因敲除位點（圖2）。靶位點序列前加保護堿基和啟動子序列，靶位點序列后加gRNA骨架上游序列，將此作為正向引物gRNA1-F和gRNA2-F。gRNA骨架下游序列作為反向引物gRNA-R。

圖2 myo7ab基因靶位點示意圖Fig.2 The diagram of myo7ab gene targeting site

2.3 myo7ab基因注射有效性檢測與分析

為了檢驗靶位點是否有效，本文按1.2.3中所述方法將注射后胚胎進行基因型鑒定，結果顯示，1、2、4和5號泳道除了野生型條帶外，下方有一條較弱的小帶，證明選擇的兩個靶位點都有效（圖3）。

圖3 gRNA有效性分析Fig.3 Effectiveness analysis of gRNA

2.4 F0代突變體篩選

將注射有效的剩余胚胎養至成魚，對成魚剪尾進行基因型鑒定（圖4）。結果顯示，1、2、3號成魚攜帶突變基因。

圖4 F0代兩個月幼魚篩選Fig.4 Two months F0 juvenile screening

2.5 穩定遺傳突變體的篩選

本試驗將篩選到的F0代突變體與野生型斑馬魚雜交，得到F1代，收集F1代斑馬魚胚胎，進行DNA鑒定，結果顯示F0代突變體可穩定遺傳（圖5a）。隨后將較小的條帶進行切膠回收并送公司測序，峰圖顯示兩個靶位點都出現堿基缺失(圖5b)。將測序序列在NCBI blast數據庫中進行比對，發現突變體的兩個靶位點之間都有堿基缺失，其中第一號靶位點與第二號靶位點間缺失58 bp，第二號靶位點3'端缺失30 bp，這證明兩個靶位點都有效并造成大片段的缺失（圖5c）。將剩余的F1代胚胎養至2個月的幼魚，再逐條剪尾進行基因型鑒定（圖5d），獲得可穩定遺傳的F1代魚，說明敲除品系構建成功。

圖5 F1代突變體篩選Fig.5 F1 generation mutant screening

3 討論

本文通過CRISPR/Cas9技術對斑馬魚進行了myo7ab基因的基因敲除試驗，成功構建了能夠穩定遺傳的myo7ab基因突變品系。將F1代myo7ab基因雜合突變體成魚自交，觀察F2代myo7ab基因純合突變胚胎，其外表未出現明顯缺陷（圖6），這說明基因敲除后不影響整體胚胎發育，但是該基因是否引起細微結構、離子通道功能的改變目前尚不清楚。

圖6 myo7ab基因純合突變胚胎整體發育正常（50×）Fig.6 myo7ab null mutant has no obvious defect (50×)

MYO7A基因突變導致人類Usher1B型綜合癥，患者在出生后即表現為重度耳聾，隨后在10歲左右出現視網膜色素變性癥狀。Usher1B型綜合征的癥狀表現使基因治療成為可行方案。目前已有研究利用插入小鼠Myo7a基因的腺相關病毒（adenoassociated viruses，AAV）對Myo7a基因突變小鼠進行基因治療［15］。盡管對小鼠Myo7a突變品系已進行了諸多研究，但在大多數小鼠模型中沒有出現視網膜色素變性表型，因此，很多關于視網膜色素變性的病理機制的假說難以在小鼠模型中得到證實［16-18］。斑馬魚作為模式動物，具有試驗周期短，通體透明易觀察等特點，被廣泛應用于發育生物學研究［19-20］。利用CRISPR/Cas9技術構建斑馬魚myo7a基因突變模型，或能彌補小鼠Myo7a突變模型無視網膜異常表型的缺陷。

斑馬魚中存在myo7aa和myo7ab兩個拷貝，后續將通過建立myo7aa基因敲除品系，以及myo7aa/myo7ab雙基因敲除品系，探究兩個拷貝之間的相互關系，并觀察其表型，進行基因功能研究。