1 株產色素毛殼菌的分離鑒定及其生物學特性

李 亞 唐紹榮 程波普 楊 斌 趙 寧,

（1.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明，650233；2.彌渡縣林業有害生物防治檢疫局，云南 大理，675600；3.西南林業大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明，650233）

色素在人們的日常生活中及各類化工領域都有著廣泛的應用，隨著人民生活水平的不斷提高，人們對于色素質量的要求也越來越高[1]。由于生態文明型社會發展的需求，天然色素進入了一個快速發展的時代。天然色素來源于天然資源，分為植物色素、動物色素、微生物色素和礦物質色素[2-3]。天然色素的來源賦予色素較高的安全性，受到了人們的青睞。但植物色素、動物色素和礦物質色素相對于微生物色素因為資源的有限性，發展受到了一定的限制。而微生物色素因其性質穩定，生產不受時間、空間限制等特點更受青睞[4-5]。

現有的研究表明，微生物色素不僅在食品中有著廣泛應用，在醫藥、化妝品、染料等方面也有著很大的發展前景[6-8]。王金字等[9]介紹了紅曲色素在食品中的應用；徐春明等[10]介紹了醌類色素有抗癌、抗菌的作用；徐銀莉等[11]使用紫紅絲膜菌色素對羊毛織物進行染色，發現該色素有較好的染色效果。目前報道的真菌色素已有600 多種[12]，而對于已開發的微生物色素，如黑色素、紅曲色素、藍色素、黃色素等[13-14]都有了一定的研究，其中對于紅曲色素的應用和研究最為廣泛[15-17]。天然的紅曲色素是一種穩定性好，安全性高的色素，不僅能用于傳統的食品染色，還具有抑制膽固醇合成、降血壓、預防老年癡呆等多種保健功能[18-19]。天然紅色素有重要的應用價值，但是目前用于生產紅色素的微生物菌種非常有限，據報道主要為紅曲霉屬（Monascus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）等[1-3,20-21]，因此從自然界中篩選高產紅色素的優良菌種具有重要的意義。

毛殼菌（Chaetomiumspp.）屬于子囊菌門（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomycetes）、糞殼菌目（Sordariales）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）[22]，其分布廣泛，植物殘體、土壤、動物糞便、木材等類群中都有存在[23]。現有研究表明，毛殼菌主要作為生防菌在植物病害中使用，如球毛殼菌（C.globosum）、角毛殼菌（C.cupreum）、近緣毛殼菌（C.subaffine）等都能產生具有抗菌活性的物質，在病原真菌引起的多種植物病害中均有應用[24-27]；但目前對毛殼菌產色素的研究報道較少。中國是核桃生產大國，截至2018 年底種植面積超過795.5 億m2[28]，極易從核桃枝干中獲取毛殼菌。本研究從核桃枝干中分離到1 株產紅色色素的菌株，并通過形態觀察和分子生物的方法確定該毛殼菌的分類地位，對其生物學特性及產色素規律進行研究，為進一步研究和應用該菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從云南省大理白族自治州云龍縣（海拔2044 m，25°44′47″N，99°34′20″E）采取的核桃枝干上分離得到。

1.2 菌株的分離純化

采用組織分離法從核桃枝干中進行菌株的分離，將核桃枝干用自來水清洗干凈，取大小為5 mm×5 mm 的組織塊，用75% 的乙醇浸泡30 s，0.1%的升汞消毒30 s，無菌水清洗3 次，將消毒后的組織塊放置于PDA 培養基上，25 ℃培養3 d，待長出菌落后，挑取菌落進一步培養，于PDA 培養基上獲得編號為YLHT?2A 的菌株。

1.3 菌株的形態觀察

將菌株YLHT?2A 接種于PDA 培養基上，放置于25 ℃環境下培養，每天觀察記錄菌落的生長特征。在菌落的不同生長時期取菌絲放置于載玻片上，載玻片事先滴1 滴蒸餾水，覆蓋上蓋玻片，放置于光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子等顯微結構。

1.4 菌株的分子生物學鑒定

用真菌基因組試劑盒提取菌株DNA，以引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC ）進 行PCR 擴增[29]。PCR 反應體系（50 μL）為：2×Buffer 25 μL，DNA 模板1 μL，正反引物各1 μL，Taq酶1 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應條件：預變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，3 min；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；30 個循環，72 ℃延伸10 min。將擴增產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往北京擎科生物科技有限公司進行測序。將測定的DNA 序列結果在NCBI 中進行BLAST 比對，選擇同源性較高的序列在MEGA 7.0 中以Neighbor-Joining（NJ）法構建系統發育樹，確定菌株的分類地位。

1.5 生物學特性研究

1.5.1 不同培養基對菌株生長及色素的影響

使用滅菌打孔器打取直徑大小一致的菌塊接種在PDA、SDAY、LB、查氏和淀粉5 種不同的固體培養基上，每種處理做5 個重復，將其放置于25 ℃的恒溫培養箱中，每天觀察并在5、7、10 d 時以十字交叉法測量不同培養基上菌落的大小，并在培養至第10 天時以蒸餾水為溶劑，溫度60 ℃，功率100 W，時間20 min 的條件，采用超聲提取紅色素并在510 nm 處檢測吸光值[30-31]，綜合菌落直徑和色素吸光值指標，篩選出最佳培養基，為后續研究提供基礎條件。

1.5.2 溫度對菌株生長及產色素的影響

以PDA 培養基為基礎培養基，將菌株YLHT?2A 打取相同大小的菌塊放置在5、10、15、20、25、30、35 ℃的條件下培養，每種處理做5 個重復，每天觀察并以十字交叉法測量不同培養溫度下菌落的大小，并在培養至第10 天時采用超聲粗提取其所產色素，色素含量測定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標，篩選出最佳培養溫度。

1.5.3 pH 對菌株生長及產色素的影響

將PDA 培養基滅菌后使用1 mol/L 的鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將pH 調節為4、5、6、7、8、9、10 共7 個梯度，將菌塊接種于不同處理的培養基上，每種處理做5 個重復，每天觀察并以十字交叉法測量不同培養基上菌落的大小，并在培養至第10 天時采用超聲粗提取其所產色素，色素含量測定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標，篩選出最適合菌株生長的pH 條件。

1.5.4 光照對菌株生長及產色素的影響

以PDA 培養基為基礎培養基，將菌株放置在24 h 黑暗，24 h 光照，12 h 光暗交替的培養環境中，每天觀察并以十字交叉法測量不同培養基上菌落的大小，并在培養至第10 天時采用超聲粗提取其所產色素，色素含量測定方法參照1.5.1，綜合菌落直徑和色素吸光值指標，篩選出最佳培養光照條件。

1.6 數據處理

使用SPSS 22.0 軟件，采用LSD 事后多重比較方法對各處理組數據進行差異顯著性分析[32]。

2 結果與分析

2.1 菌株的菌落特征與形態鑒定

從核桃枝干中經組織分離法篩選得到1 株高產紅色色素的菌株YLHT?2A，其菌落特征及有性產孢結構見圖1。由圖1 可看出，該菌株在生長的過程中會有紅色物質產生使培養基著色。菌落絨狀，淺黃色，有紅色物質溢出，培養基平板變紅色，后期出現明顯的淺黃色和紅白相間的環紋，邊緣菌落呈淺綠色，培養基平板紅色加深，菌落背面紅色。

圖1 菌株YLHT?2A 的菌落特征及有性產孢結構Fig.1 Colony characteristics and sporulation structure of strain YLHT?2A

將菌株YLHT?2A 的菌絲、子囊、子囊果置于顯微鏡下觀察看出，子囊果表生，反射光下呈灰綠色，卵形或近球形，著生有附屬絲，大小為193～203 μm×91～121.5 μm；子囊果壁細胞褐色，易破碎，果壁細胞多為不規則的多邊形，呈網格狀排列；子囊棍棒狀，具柄，內有8 個子囊孢子，子囊壁易消解，大小為22～30 μm×10～12.5 μm；子囊孢子兩側不對稱呈紡錘形或舟形，初期顏色較淺，成熟后呈灰褐色，大小為8.5～11.5 μm×4.5～5.5 μm。

2.2 菌株的分子鑒定

測序得到菌株YLHT?2A 的ITS 序列長度為579 bp，將測序結果 在NCBI 中進行BLAST 比對，發現菌株YLHT?2A 與C.aureum同源性高達99.46%。選取同源性高的序列在MEGA 7.0 軟件中序列比對后，根據Kimura 2?parameter 法計算遺傳距離，以NJ 法Bootstrap 1000 次后構建系統發育樹。根據圖2 構建的ITS 序列進化樹可看出，菌株YLHT?2A 與3 株C.aureum菌株在同一分支，Bootstrap 檢驗值為99，說明發育樹表示的菌株YLHT?2A 與3 株C.aureum之間的進化關系可信。結合形態學結果及ITS 基因序列的分析結果，可將菌株YLHT?2A 鑒定為金色毛殼C.aureum[33-35]。將菌株YLHT?2A 的核酸序列提交到GenBank，得到菌株序列號為MT003228。

2.3 生物學特性

2.3.1 培養基種類對YLHT?2A 菌株生長及產色素的影響

C.aureumYLHT?2A 菌絲在不同培養基中生長及產色素具有差異性（圖3）。結果表明，菌絲在5 種培養基上均能生長，培養至第10 天時，PDA 培養基上的菌落直徑達到4.72 cm，而淀粉培養基上的菌落直徑為5.15 cm，與其他3 種培養基上的生長情況存在顯著差異（P<0.05）。而在培養至第10 天時檢測不同培養基中產生的色素含量發現，PDA 培養基最適合色素分泌，與另外4 種培養基的色素產量差異顯著（P<0.05）。

圖3 不同培養基對C.aureum 生長及產色素的影響Fig.3 Effects of different media on C.aureum growth and pigment production

2.3.2 溫度對YLHT?2A 菌株生長及產色素的影響

溫度對C.aureumYLHT?2A 菌絲的生長及產色素具有差異性（圖4）。結果顯示，菌絲在低于15 ℃的條件下不能生長，而在20～35 ℃的范圍內均能生長，并且30 ℃是最適宜C.aureum生長的，在培養至第10 天時，其菌落直徑可達6.48 cm，與其他培養溫度條件存在顯著差異（P<0.05）。

在培養至第10 天時，提取不同溫度下培養菌株所產的色素發現，溫度低于15 ℃時菌株不產生色素，在30 ℃時菌株所產的色素含量最高，且其色素含量與25 ℃和35 ℃條件下存在顯著差異（P<0.05）。由圖4 可看出，在不同的培養溫度下，C.aureum的菌落生長速度與色素產生量變化趨勢一致，30 ℃是最適合C.aureum生長的溫度。

圖4 溫度對C.aureum 生長及產色素的影響Fig.4 Effects of temperature on C.aureum growth and pigment production

2.3.3 pH 對YLHT?2A 菌株生長及產色素的影響

圖5 顯示pH 影響菌絲的生長及產色素情況。C.aureumYLHT?2A 在pH 為4～10 的條件下均能生長，但在中堿性的條件下生長狀況更好，且在pH>6 的條件下菌落生長情況差異不顯著（P>0.05）。

圖5 pH 對C.aureum 生長及產色素的影響Fig.5 Effects of pH on C.aureum growth and pigment production

在培養至第10 天時，提取不同pH 下培養菌株所產的色素發現，在酸性條件下，C.aureum產生的色素較少，pH 為4 時，其所產生的色素圈顏色較淺。而隨著pH 的增大，色素的含量越高，pH 為10 時產生的色素含量最大（P<0.05）。而在pH 等于6、7、8 的條件下，其色素含量無明顯差異。

2.3.4 光照對YLHT?2A 菌株生長及產色素的影響

從圖6 中可以看出，不同的光照條件對C.aureum的菌落生長情況無顯著差異，在不同光照條件下菌株均可以正常生長。

圖6 光照對C.aureum 生長及產色素的影響Fig.6 Effects of light on C.aureum growth and pigment production

在培養至第10 天時，提取不同光照條件下培養菌株所產的色素發現，其所產生的色素在12 h光暗交替的條件與全黑暗和全光照的條件下培養的含量差異不顯著，全黑暗與全光照培養條件下的色素含量存在顯著差異（P<0.05），全黑暗條件下所培養的色素含量顯著高于全光照條件下培養所產生的。

3 結論與討論

本研究從核桃枝干中分離到1 株產紅色素的菌株YLHT?2A，結合形態學和分子生物學的方法將該菌株鑒定為金色毛殼C.aureum，其最佳培養條件為PDA 培養基，培養溫度30 ℃、全黑暗及pH 為10。

通過對C.aureum在不同環境下的培養觀察，發現不同的培養條件下，菌株的生長速率及色素OD510存在差別。篩選不同的生長培養基發現，C.aureum在5 種培養基上均能生長，但菌落形態存在差異，綜合菌落生長和色素OD510的指標，判斷PDA 培養基是最佳培養基；篩選最佳培養溫度，發現菌株在20～35 ℃的條件下均能生長，低于15 ℃的條件不適合菌落和色素的培養，其中在30 ℃時最適合C.aureum生長，此時菌落生長速度與色素產生的變化規律一致；篩選最佳pH，發現C.aureum在pH 為4～10 的范圍內均能生長，對酸堿度較不敏感，但堿性條件下的生長狀況要優于酸性條件；而C.aureum的產色素情況對酸堿度較為敏感，在pH 為4 時，所產的色素較少，隨著堿性增強，色素OD510增大。綜合考慮，堿性條件pH 為10 時更適合C.aureum生長；篩選最佳培養光照條件發現，C.aureum菌株生長對光照條件的需求不嚴格，在24 h全光照、24 h 全黑暗和12 h 光暗交替的條件下均能生長，且差異不顯著，但C.aureum所產的色素在24 h 全黑暗的條件下OD510更高。

金色毛殼菌C.aureum是一種非常重要的資源真菌，通常被作為生防菌使用[36]。早在1975年[37]，就有人對其進行了研究。Wang 等[38]探究發現C.aureumMF?91 對稻瘟病菌和紋枯病菌有一定的抑制作用；Kabbaj 等[39]對C.aureum產生的活性物質進行了研究，目前國內外對C.aureum的研究主要集中在其生防作用上。李靜等[33]對多種毛殼菌的生長溫度特性進行探究，發現菌株生長溫度可以作為毛殼屬物種鑒定的一個指標。而對于C.aureum可以分泌色素的情況，譚悠久[34]在其分類鑒定得到的菌株中發現C.aureum可以產生無色分泌物；張豐[35]鑒定得到的C.aureum可以產生紅色分泌物使PDA 培養基變紅，說明不同的菌株在生物學特性方面會存在一定的差異。但對其產色素的研究尚未見相關報道。天然微生物色素在色素市場上具有很強的競爭力，開發新的可產色素的菌株對于色素市場有重要的經濟價值。據統計，目前主要的微生物色素有紅、橙、黃、綠、青、藍、紫、褐色和黑色等，其中天然紅色素被廣泛的應用到食品和醫療行業，產紅色素的菌株以紅曲霉研究最多[40]。目前市場上真菌所產的紅色素，如張立強等[41]研究的黑曲霉菌（Aspergillus niger）所產的紅色素在pH 為5～9 的條件下保持穩定；劉維等[42]對一株鐵皮石斛內生真菌所產的紅色素進行研究，發現該菌所產色素對自然光和溫度較為穩定，而在pH>7的環境下穩定性更好，本研究中的C.aureum在pH 為4～10，以及不同光照條件下均能繼續分泌紅色素，說明菌株YHLT?2A 所產的色素有著極好的穩定性，對酸堿的耐受性較好，有進一步開發利用的潛力。本研究從核桃中分離得到了1 株產紅色素的毛殼菌，拓寬了產紅色素菌種資源的來源。對該菌株進行了形態和分子描述，并對該菌株的基本培養特性與產色素之間的關系進行了探究，為毛殼菌屬菌種資源的分類鑒定及開發利用提供了相關理論依據。