基于中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)的“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的作用機(jī)制研究

楊彗敏，李敏慧，徐 男，門(mén)連匯，顧郁欣，王 悅，白 雪，羅汝婳，劉蒙蒙，田慶常，章洪華，王淑玲

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，浙江 杭州 311121；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

胃炎歸屬于中醫(yī)“胃脘痛” “痞滿” “納呆”等范疇。臨床數(shù)據(jù)[1]表明，中醫(yī)中藥能使輕、中度的胃炎病理改變減輕，甚至逆轉(zhuǎn)。小柴胡湯和半夏瀉心湯出自東漢張仲景的《傷寒論》，均是調(diào)和腸胃、治痞之良方，方中柴胡有和解表里、疏肝升陽(yáng)之功效，半夏降逆止嘔，消痞散結(jié)。“半夏-柴胡”藥對(duì)是該方關(guān)鍵組合，基本可體現(xiàn)全方之效用，起寒熱并用、調(diào)其陰陽(yáng)、疏肝和胃、消痞止痛之效，恰合慢性胃炎病證，對(duì)治療胃炎有較好療效[2]。

中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine of Integrated Pharmacology，TCMIP，http://www.tcmip.cn/)是包含大量中藥相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，主要從中藥、中藥單體成分、疾病和靶標(biāo)4個(gè)層面對(duì)中藥或復(fù)方的藥理作用進(jìn)行分析研究[3]。本研究通過(guò)中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)，采用中藥整合藥理學(xué)分析手段，對(duì)“半夏-柴胡”藥對(duì)進(jìn)行研究，分析中藥有效成分與靶標(biāo)的相互作用，探究其可能的作用通路，構(gòu)建“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的“中藥(藥對(duì))-成分-靶標(biāo)-通路”的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，為相關(guān)處方的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分分析 依據(jù)《中國(guó)藥典》(2015年版)，收集關(guān)于“半夏” “柴胡”的化學(xué)成分信息，包括中文名、英文名、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、2D分子結(jié)構(gòu)、3D分子結(jié)構(gòu)等，并根據(jù)整合藥理學(xué)平臺(tái)TCMIP中的操作方法，將其導(dǎo)入中藥整合藥理學(xué)系統(tǒng)，建立“半夏” “柴胡”相關(guān)化學(xué)成分信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 “半夏-柴胡”藥對(duì)候選靶標(biāo)提取 在中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)中，添加半夏、柴胡藥材，并將疾病靶標(biāo)關(guān)鍵詞設(shè)為“gastritis(胃炎)”進(jìn)行檢索。在中藥靶標(biāo)預(yù)測(cè)界面，通過(guò)OpenBabel軟件研究“半夏-柴胡”藥對(duì)中的化學(xué)成分和分子指紋[3]，將藥對(duì)中化學(xué)成分的二維結(jié)構(gòu)與FDA已上市藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)指紋特征比對(duì)。將Jaccard系數(shù)大于0.8的藥物靶標(biāo)作為“半夏-柴胡”藥對(duì)作用的候選靶標(biāo)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用整合藥理學(xué)平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，參照建立的“半夏-柴胡”藥對(duì)作用的候選靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫(kù)與 “gastritis” 疾病靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)[4]，具體方法：卡值選用“節(jié)點(diǎn)連接度(degree)”的 2 倍中位數(shù)，節(jié)點(diǎn)選擇中藥靶標(biāo)與相關(guān)疾病的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)；在進(jìn)一步的節(jié)點(diǎn)選擇中，需要選取“節(jié)點(diǎn)連接度(degree)” “節(jié)點(diǎn)介度(betweenness)” “節(jié)點(diǎn)緊密度(closeness)”3個(gè)方面的中位數(shù)同時(shí)滿足的節(jié)點(diǎn)。在節(jié)點(diǎn)選擇結(jié)束后，將節(jié)點(diǎn)及所得到的靶標(biāo)構(gòu)建“半夏-柴胡”藥對(duì)潛在靶標(biāo)與治療胃炎靶標(biāo)之間相互作用的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)對(duì)通路富集分析處理轉(zhuǎn)化，得到直觀可視的“半夏-柴胡”藥對(duì)抗胃炎作用機(jī)制的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖譜。另外，整合藥理學(xué)平臺(tái)還運(yùn)用其他數(shù)據(jù)庫(kù)，例如Reactome、HAPPI、InAct等數(shù)據(jù)庫(kù)，可以通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息(PPI)數(shù)據(jù)庫(kù)，或者直接獲得“半夏-柴胡”藥對(duì)作用潛在靶標(biāo)與胃炎疾病靶標(biāo)之間的蛋白質(zhì)相互作用的信息。

1.4 GO功能和通路分析 采用基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.geneontology.org/)進(jìn)行基因GO功能分析，采用京都基因和基因組百科全書(shū)通路數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)(http：//www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 “半夏-柴胡”藥對(duì)中化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶標(biāo) 經(jīng)TCMIP分析，得到“半夏-柴胡”藥對(duì)中103個(gè)活性成分，其中柴胡62個(gè)、半夏41個(gè)。半夏41個(gè)活性成分共對(duì)應(yīng)237個(gè)靶標(biāo)、柴胡62個(gè)活性成分共對(duì)應(yīng)657個(gè)靶標(biāo)。設(shè)定相似性分?jǐn)?shù)≥0.8，篩選中藥活性成分的預(yù)測(cè)靶標(biāo)共291個(gè)，其中柴胡活性成分對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)靶標(biāo)95個(gè)，半夏活性成分對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)靶標(biāo)196個(gè)，兩者共有靶標(biāo)22個(gè)。

采用GO功能分析，對(duì)“半夏-柴胡”藥對(duì)291個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示“半夏-柴胡”藥對(duì)的分子功能主要涉及胞外谷氨酸門(mén)控離子通道活性(extracellular-glutamate-gated ion channel activity)、細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)、離子型谷氨酸受體信號(hào)通路(ionotropic glutamate receptor signaling pathway)、蛋白質(zhì)翻譯的tRNA氨酰化(tRNA aminoacylation for protein translation)等。采用KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“半夏-柴胡” 預(yù)測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果顯示，“半夏-柴胡” 藥對(duì)主要涉及谷氨酸突觸(glutamatergic synapse)、氨酰-tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine, aspartate and glutamate metabolism)等通路。

2.2 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo) 利用TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)中PPI相互作用分析平臺(tái)，分析“半夏-柴胡”藥對(duì)291個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)與胃炎相關(guān)靶標(biāo)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，共篩選出胃炎疾病靶標(biāo)319個(gè)，與“半夏-柴胡”藥對(duì)重疊的靶點(diǎn)有149個(gè)。選擇degree前100名的候選靶標(biāo)用cytoskaper軟件繪制網(wǎng)絡(luò)(圖1)，degree的高度與節(jié)點(diǎn)的大小成正比，degree高度排前5位的分別為：腺苷酸環(huán)化酶1 (adenylate cyclase 1, ADCY 1)、腺苷酸環(huán)化酶2(adenylate cyclase 2, ADCY 2)、G蛋白偶聯(lián)β1受體 (recombinant G protein beta 1, GNβ1)、腺苷酸環(huán)化酶5(adenylate cyclase 5, ADCY 5)、磷酸化蛋白激酶1 (phosphorylated protein kinase 1, p-Akt1) 受體，分別與70個(gè)、70個(gè)、62個(gè)、60個(gè)、60個(gè)疾病靶標(biāo)有相互作用。

注：紅色代表候選藥物靶標(biāo)。圖1 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)Figure 1 The candidate target network of Pinellia ternata-Bupleuri Radix for the treatment of gastritis

2.3 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)基因功能 對(duì)149個(gè)“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)基因進(jìn)行GO功能分析，分子功能主要涉及蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、GTP酶活性(GTPase activity)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、焦點(diǎn)黏附(focal adhesion)、血小板活化(platelet activation)等(表1)。

表1 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)基因功能信息Table 1 Functional information of candidate target genes for the treatment of gastritis by Pinellia ternata-Bupleuri Radix

表1(續(xù))

2.4 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)通路信息 采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)149個(gè)“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)進(jìn)行通路富集后，按照P值排序統(tǒng)計(jì)排位前20條的通路(表2)，主要涉及通路包括：趨化因子信號(hào)通路、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、雌激素信號(hào)通路、物質(zhì)依賴、嘌呤代謝、乙型肝炎、核苷酸代謝等。

表2 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)通路信息Table 2 Information on candidate target pathways of Pinellia ternata-Bupleuri Radix for the treatment of gastritis

2.5 “半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系 利用TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)，采用cytoskaper 軟件構(gòu)建“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的“中藥-成分-靶標(biāo)-通路”可視多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見(jiàn)圖2。

注：綠色代表中藥，紫色代表化學(xué)成分，藍(lán)色代表靶標(biāo)，橙色代表通路。圖2 “半夏-柴胡”治療胃炎的 “中藥-成分-靶標(biāo)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Figure 2 Multi-dimensional network relationship diagram of “Chinese medicine-components-targets-pathways” of Pinellia ternata-Bupleuri Radix in the treatment of gastritis

3 討論

基于大數(shù)據(jù)，結(jié)合中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，全面認(rèn)識(shí)中醫(yī)經(jīng)方的藥理作用是當(dāng)前研究中藥藥理學(xué)機(jī)制的重要方法[5-7]。TCMIP 利用人工智能數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)合當(dāng)前網(wǎng)絡(luò)及大數(shù)據(jù)，科學(xué)地構(gòu)建了智能化和網(wǎng)絡(luò)化的數(shù)據(jù)平臺(tái)，可用于分析多種中藥的活性單體成分與疾病相關(guān)的靶標(biāo)及通路之間的聯(lián)系，形成直觀的網(wǎng)絡(luò)圖譜，揭示中藥潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探索藥效作用的分子機(jī)制，為經(jīng)方的研究提供了方法[8-9]。

目前對(duì)于胃炎的病因和發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，主要包括幽門(mén)螺桿菌感染(引起的疣狀胃炎更易發(fā)生腺體萎縮、腸化及異型增生)、膽汁反流(損傷胃黏膜)、血管活性因子及細(xì)胞因子改變(血管活性腸肽減少)、免疫因素(繼發(fā)性自身免疫反應(yīng))、年齡因素(胃炎的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān))和其他因素(飲食、藥物、肥胖等)。小柴胡加半夏瀉心湯是經(jīng)典名方，“半夏-柴胡”藥對(duì)是該方的關(guān)鍵藥材。研究[10]表明，半夏主要含生物堿類、有機(jī)酸類、甾醇類、揮發(fā)油類、氨基酸類、黃酮類等化學(xué)成分，其中半夏生物堿包括麻黃堿、腺苷、次黃嘌呤核苷、鳥(niǎo)苷等，具有抗炎作用，是治療胃炎的主要藥理活性成分。柴胡主要含揮發(fā)油、黃酮類、皂苷類、木脂素類、多糖類等。研究[11]表明，柴胡揮發(fā)油中石竹烯、欖香烯等成分及柴胡皂苷具有抗炎作用，為治療胃炎的活性成分。本研究共篩選出“半夏-柴胡”藥對(duì)活性成分103個(gè)，其中柴胡有62 個(gè)，半夏有41個(gè)。“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)基因有149個(gè)，其中ADC1、ADC2、和ADC5屬于腺苷酸環(huán)化酶(AC)，能將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，催化生成環(huán)腺苷-3’,5’-磷酸(cAMP)，通過(guò)調(diào)控cAMP引起胞內(nèi)變化而產(chǎn)生生理反應(yīng)。另外，“半夏-柴胡”藥對(duì)的候選靶標(biāo)GNβ1參與多種受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，GNβ1受損可引起嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病。對(duì)“半夏-柴胡”藥對(duì)治療胃炎的候選靶標(biāo)進(jìn)行通路富集，主要涉及的信號(hào)通路有神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、趨化因子和雌激素等。但TCMIP預(yù)測(cè)和提示的藥物潛在靶點(diǎn)和通路還需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)中藥整合藥理學(xué)平臺(tái)的預(yù)測(cè)和分析，“半夏-柴胡”具有103個(gè)活性成分，可作用149個(gè)治療胃炎的候選靶標(biāo)，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、趨化因子途徑等信號(hào)通路，發(fā)揮抗胃炎的作用。