春尺蠖小熱激蛋白基因AcinHsp19.4的表達與序列分析*

陳龍 單艷敏 田彥軍 崔闊澍

1.河套學院，內蒙古巴彥淖爾

2.內蒙古自治區草原工作站，內蒙古呼和浩特

3.鄂托克草原工作站，內蒙古鄂托克旗

4.四川省農業技術推廣總站，四川成都

熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是一種受外界環境壓力刺激可在體內迅速合成且保守性很高的蛋白，在逆境發生時，通過與解析蛋白結合，從而防止蛋白自發折疊而喪失生物活性[1-2]。根據熱激蛋白的同源性和分子量可劃分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白等家族[3]。小分子熱激蛋白的分子量分布較為分散，大小為12～42 kD，具有保守的α-晶體結構域，在序列結構、分子量大小與功能上具有多樣性且同源性較低[4-6]。此外，小分子熱激蛋白還包括生命必需蛋白[7]。昆蟲小分子熱激蛋白在饑餓脅迫中也具有重要作用，例如，當利用RNAi技術沉默赤擬谷盜HSP18.3基因時，饑餓組的抗性顯著低于對照組[8]。目前，雖然在雙翅目、鱗翅目和膜翅目昆蟲中發現多種小分子熱激蛋白，但是在其它昆蟲中卻只有很少的小熱激蛋白被鑒定出來[9]，更深入的功能研究則更少[10]。因此，開展昆蟲小分子熱激蛋白的研究有助于全面地了解昆蟲小分子熱激蛋白的功能。

春尺蠖屬鱗翅目、尺蛾科，是一種雜食性害蟲，在我國多個省、自治區被列為重點監測對象[11-12]。近年來，春尺蠖危害呈擴大趨勢，危害對象由楊、柳、桑、檸條和梨等林木，逐漸擴大至開始危害玉米、小麥等農作物，危害區域從內蒙古、新疆等北方地區逐漸向四川、云南等南部地區遷移。為深入了解熱激蛋白與春尺蠖生長發育的關系和在饑餓脅迫中的作用機理，本研究在已有轉錄組數據中篩選獲得1條小分子熱激蛋白基因，分析其蛋白理化性質以及在不同時間饑餓處理下的表達譜。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春季去烏拉特前旗檸條人工草場采集春尺蠖雌雄成蟲帶回實驗室，以檸條錦雞兒成對飼喂，待其產卵后，將卵置于人工氣候箱中在恒溫22℃±1℃，光周期L∶D=18∶6和相對濕度（RH）55%～59%條件下培養，幼蟲孵化后，用實驗室內種植的檸條錦雞兒連續飼養，選取4齡幼蟲（均為蛻皮后2 d）以備試驗。

1.2 研究方法

1.2.1 饑餓脅迫處理方法

對春尺蠖4齡幼蟲在不同饑餓處理（6 h、24 h和72 h，以正常飼喂檸條錦雞兒的春尺蠖4齡幼蟲為對照）條件下測定轉錄組，每個處理3次重復，每個重復10只供試昆蟲。

1.2.2春尺蠖AcinHsp19.4基因的獲取方法

根據本實驗室前期測定的春尺蠖幼蟲不同時間饑餓脅迫下轉錄組數據，以及差異基因表達趨勢圖及功能注釋信息，同時結合BlastP驗證，從中篩選出具有完整CDS序列的sHSP基因，命名為AcinHsp19.4（GenBank登錄號∶MW336984）。

1.2.3 春尺蠖AcinHsp19.4基因的生物信息學分析

利 用 NCBI ORF Finder （https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）來預測春尺蠖AcinHsp19.4基因蛋白編碼序區。使用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http∶//web.expasy.org/protparam/）預測春尺蠖AcinHsp19.4基因編對AcinHsp19.4氨基酸的同源序列的一致性。應用在線預測 工 具 SignalIP5.0 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測AcinHsp19.4基因N端信號肽。采用TMHMM 軟 件 （http∶//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對蛋白跨膜區域進行預測。利用MEGA6.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ），同時采用P距離（P-distance）重復運行1 000次重復構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 春尺蠖Acin Hsp19.4基因在饑餓脅迫下的表達分析

從圖1中可以看出，AcinHsp19.4基因的表達量呈現上升趨勢，在處理0 h（對照CK）、6 h和24 h后，表達量差異不顯著，直到處理72 h后，表達量迅速上升且差異顯著（P＜0.05）。

2.2 AcinHsp19.4基因蛋白的理化性質分析

春尺蠖Acin Hsp19.4基因蛋白預測分子式為C872H1359N233O261S3，序列全長516 bp，共編碼171個氨基酸，蛋白質分子量為19.38 kD，等電點為5.56；半衰期和脂肪指數分別為30 h和78.01，負電荷殘基（Asp+Glu）總電荷的27高于正電荷殘基（Arg+Lys）總電荷的22；該蛋白的親水性為-0.560，為疏水性蛋白。不穩定系數為40.33，大于參考值40，故其為不穩定蛋白。該蛋白具有小分子熱激蛋白典型的α-晶體結構域。AcinHsp19.4在N端不含信號肽且無跨膜區。

2.3 春尺蠖基因的同源性比對及系統進化關系分析

將春尺蠖AcinHsp19.4基因的氨基酸序列（圖2）與NCBI中搜索得到的其它昆蟲序列進行比對，分析結果表明，春尺蠖AcinHsp19.4基因氨基酸序列與同為尺蛾科的樺尺蠖一致性最高，達到87.72%，其次為家蠶和斜紋夜蛾，分別達到69.77%和69.71%，而與其它鱗翅目昆蟲一致性較低，均低于60.00%，其一致性分別為吊絲蟲59.43%，二化螟55.56%，粘蟲55.00%，云杉芽卷蛾52.78%。

圖 1 AcinHsp19.4在春尺蠖不同時間饑餓處理下的表達譜

圖 2 春尺蠖AcinHsp19.4基因的核苷酸及推導的編碼氨基酸序列（A）及序列包含的保守結構域（B）

圖 3 春尺蠖與其它昆蟲sHsp基因的氨基酸序列比對

圖 4 春尺蠖與其它昆蟲sHSP氨基酸序列構建的系統進化樹

通過NCBI搜索其他目昆蟲已上傳的sHsp的氨基酸序列與春尺蠖AcinHsp19.4序列信息（圖3）結合，構建系統進化樹。結果顯示（圖4），進化樹中的各鱗翅目昆蟲分別聚在不同分支上；在鱗翅目的分支上春尺蠖的sHSP與同為尺蛾科的樺尺蠖的sHSP聚為一類，表明二者親緣關系最近，其次為夜蛾科的草地貪夜蛾和斜紋夜蛾，與鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中華稻蝗親緣關系逐次變遠。

3 討論

本研究在前期已測春尺蠖4齡幼蟲不同時間饑餓處理下的轉錄組數據庫中篩選得到1條小分子熱激蛋白基因，經BlastP比對發現其包含小熱激蛋白典型的α-晶體結構域，結合同源序列比對與系統進化結果，推測該基因為春尺蠖小分子熱激蛋白。小分子熱激蛋白具有的典型結構域不僅在分子識別中起到重要作用，而且在分子伴侶功能方面扮演著重要角色，同時是sHSP的典型特征，在分子進化分析的研究中具有重要作用[13，14]。

系統進化結果表明，鱗翅目、鞘翅目和直翅目昆蟲分別聚在不同分支上，在鱗翅目分支上春尺蠖Hsp19.4與同為尺蛾科的樺尺蠖Hsp19.4聚為一類，與鞘翅目的谷斑皮蠹，直翅目的中華稻蝗親緣關系逐次變遠；分子量相近或相同的sHSP則分別聚在一支。在棉鈴蟲中也出現了類似的結果，說明sHSP不僅具有保守性，同時具有種屬的特異性[15]。

昆蟲在漫長的進化過程中，為了抵御外界不利環境的脅迫，自身進化出很多防御措施，其中熱激蛋白表達的調節就是一種手段[16，17]。近年的研究表明，熱激蛋白在昆蟲應對饑餓脅迫方面發揮著重要作用[18，19]。例如，熱激蛋白HSP70在異色瓢蟲在饑餓處理8 h后表達量達到峰值[20]。利用RNAi技術沉默赤擬谷盜Hsp18.3基因后，其耐饑餓能力顯著下降[8]。在本研究中，AcinHsp19.4在饑餓處理72h后，表達量上調表達，與上述研究結果一致，說明Acin Hsp19.4在春尺蠖應對饑餓脅迫的過程中起到重要作用。

本研究從春尺蠖轉錄組中鑒定得到AcinHsp19.4蛋白基因，并分析了分子特征和蛋白的理化性質，同時分析了其在不同時間饑餓脅迫處理下的表達情況，為下一步探究春尺蠖熱激蛋白與生長發育的關系，以及在饑餓脅迫下的作用機理奠定基礎。