當歸拈痛湯治療急性痛風性關節炎療效和作用機制的小鼠實驗研究

陳紹華 ，王沁筠 ，吳昌桂 ，趙嘯 ，徐浩 ，施杞 ，梁倩倩 *

本研究背景：

急性痛風性關節炎（AGA）并非單一因素致病，多數AGA患者采用常規對癥治療效果不理想且不良反應較多。中藥復方以多成分、多靶點作用而在降尿酸、緩解AGA癥狀等方面具有獨特療效，但具體作用機制尚不完全明確。

本研究創新性：

本研究首次應用C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關節周圍注射尿酸單鈉（MSU）誘導的AGA動物模型而探究當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，初步證實當歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調節炎性因子的表達、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個核心問題的有效方劑且安全性較高。

本研究局限性：

本研究為小鼠實驗，由于目前尚無穩定的高尿酸血癥小鼠模型，因此尚不能預估當歸拈痛湯對血尿酸的長期控制效果，臨床推廣尚需進行倫理學審核及大樣本量隨機對照試驗進一步驗證。

發生于第一跖趾關節的急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）是痛風的首要臨床表現，男性多發［1-2］，通常表現為劇烈疼痛伴紅腫［3］，呈急性發作性，并會逐步進展為慢性［4-5］。據統計，當前全球痛風患病率為0.1%～10.0%［6］；我國男性痛風患病率為1.20%～2.60%，女性痛風患病率為0.01%～0.72%［7-11］，近年來我國痛風患病率呈逐年升高趨勢。

AGA的發生發展主要涉及以下幾個環節：（1）機體尿酸排泄不足引發高尿酸血癥［12-13］，同時體內濃度較高的尿酸導致尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）在關節及關節周圍沉積；（2）沉積的MSU晶體與駐留的巨噬細胞相互作用而導致NLRP3炎性小體形成、激活；（3）活化的NLRP3炎性小體通過募集胱天蛋白酶1而將促白介素1β加工為成熟的白介素1β（IL-1β）［14］，進而通過活化中性粒細胞和肥大細胞放大炎性反應，最終導致一系列炎性因子、趨化因子釋放［15］。

對于AGA，若處理不當則可能導致不可逆性組織破壞、骨侵蝕，最終造成關節疼痛、僵硬［2］。目前，臨床治療AGA要求盡快開始消炎止痛、終止急性發作［16］，推薦的治療方案是應用非甾體抗炎藥、秋水仙堿及糖皮質激素［17］，但上述藥物治療作用單一、長期服用不良反應較大，同時AGA的發生是多種因素作用的結果而非由單一因素所致［1-2］，因此消炎止痛并非AGA的最佳治療方案。對于AGA的治療，不僅要終止急性炎癥發作，還要對尿酸進行有效管理并清除沉積的MSU結晶。中藥復方當歸拈痛湯是臨床治療濕熱蘊結型AGA的常用方劑，但其具體作用機制尚不清楚。本研究為小鼠實驗，旨在探討當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，以期為后續研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2020-08-17至2020-10-07實施。2020年8月，筆者所在課題組從上海杰思捷實驗動物有限公司購入30只10～12周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量為20～27 g，平均體質量為（24±3）g；實驗動物許可證號為SCXK（滬）2018-0004；飼養于上海中醫藥大學動物房并保證充足的食物和潔凈的水。本研究通過上海中醫藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.2 藥物、試劑、儀器

1.2.1 藥物 當歸拈痛湯由羌活15 g、茵陳15 g、豬苓9 g、澤瀉9 g、黃芩3 g、苦參6 g、防風9 g、升麻3 g、葛根6 g、白術3 g、蒼術6 g、黨參6 g、當歸9 g、知母9 g、（炙）甘草15 g組成，均購自上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房。0.9%氯化鈉溶液（安徽雙鶴藥業有限責任公司，國藥準字：H34023609，批號：20010808S，規格：500 ml）購自上海市長寧區天山中醫醫院藥房。

1.2.2 試劑 MSU晶體（Sigma，貨號：U2875-25G）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（Servicebio，貨號：G0002-2L）；尿酸檢測試劑盒（微板法）（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：C012-2-1）；異氟烷（沃瑞德，貨號：Batch NO.217140901，規格：100 ml）；8分鐘RNA快速提取試劑盒（EZBioscience，貨號：B0004DP），帶gDNA Remover的彩色反轉錄試劑盒（EZBioscience，貨號：A0010CGQ），ROX2 plus彩色實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）試劑盒（EZBioscience，貨號：A0012-R2）。特定基因引物購自華大基因，其中β-actin基因正向引物序列為5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，反向引物序列為5'-TAGGAGCCAGAGCAGTAATC-3'；IL-1β基因正向引物序列為5'-CTGGTACATCAGCACCTCAC-3'，反向引物序列為5'-AGAAACAGTCCAGCCCATAC-3'；腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因正向引物序列為5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3'， 反 向 引 物序 列 為5'-GAGGTTGACTTTCTCCTGGTAT-3'； 誘導型一氧化氮合酶（iNOS）基因正向引物序列為5'-AACGGAGAACGTTGGATTTG-3'，反向引物序列為5'-CAGCACAAGGGGTTTTCTTC-3'。

1.2.3 儀器 Bio Tek Cytation3細胞成像多功能檢測系統，Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀，Denovix DS-11超微量紫外可見分光光度計，Thermal cycler block 5020PCR熱循環儀，Matrx小動物專用吸入麻醉機，JY88-IIN-超聲波細胞粉碎機；Shangping FA1004N電子天平，美耐特高精度電子數字顯示游標卡尺，Hamilton 80600微升注射器（100 μl），1 ml無菌注射器（精度10 μl）和灌胃針，Eppendorf微量移液器，Costar96孔酶標板及Bio-Rad 96孔qPCR板等。

1.3 方法

1.3.1 藥劑制備方法 按照常規體質量對小鼠（25 g）與人（60 kg）中藥劑量進行換算（換算系數為9.01），則小鼠需服中藥煎劑濃度為2.56 g/ml。取上述中藥1劑，加12倍水浸泡30 min后煮沸，煮沸后繼續煎煮30 min，趁熱過濾獲得煎液1；所余藥渣加8倍水，采用同樣的煮沸方法而獲得煎液2；合并兩次煎液并置于通風櫥中加熱、濃縮至48 ml即為當歸拈痛湯中藥液，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 動物分組及AGA小鼠模型建立方法 適應性飼養1周后將30只小鼠編號并采用隨機數字表法分為對照組、溶劑組和DGNTT組，每組10只。稱取MSU晶體30 mg，溶于1.0 ml PBS并置于1.5 ml 微型離心管（EP管）中，充分震蕩后使用JY88-IIN-超聲波細胞粉碎機（強度25%、運行5 s停10 s）粉碎1 min，使其變為均勻的乳白色MSU懸液（濃度為3%）。使用Hamilton 80600微升注射器在溶劑組和DGNTT組小鼠在雙側足掌深層跖跗關節周圍注射MSU懸液，20 μl/次，隔日1次，共注射3次誘導造模；對照組小鼠在雙側足掌深層跖跗關節周圍注射PBS，20 μl/次，隔日1次，共注射3次。

1.3.3 治療方法 三組小鼠于造模完成后同時開始給藥，其中對照組和溶劑組小鼠予以0.9%氯化鈉溶液灌胃，DGNTT組小鼠予以當歸拈痛湯中藥液灌胃，均為0.2 ml/次，1次/d；三組小鼠均連續灌胃1周。

1.4 觀察指標 （1）體質量：分別于治療前后測量三組小鼠體質量；（2）足掌厚度增長百分比：注射MSU懸液后6 h通常為AGA小鼠炎性腫脹達到峰值的時間點［18］，因此分別于造模前、造模后6 h、治療后1～7 d固定時間點（每日上午10點）采用美耐特高精度電子數字顯示游標卡尺測量小鼠足掌厚度以計算足掌厚度增長百分比，注意選取小鼠足爪腫脹最甚處；（3）IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量：治療后7 d取三組小鼠注射足部組織，去皮后采用磁珠研磨，先采用8分鐘RNA快速提取試劑盒提取mRNA，再采用ROX2 plus彩色qPCR試劑盒檢測IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量，重復3次取平均值，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作；（4）血尿酸濃度：治療后7 d摘取三組小鼠眼球并采血約1 ml，靜置2 h后采用高速冷凍離心機離心（3 000 r/min、4 ℃）15 min，吸取上層淡黃色血清300～400 μl至新的EP管中并做好標記，放置于-80 ℃冰箱保存，采用尿酸檢測試劑盒（微板法）、酶比色法檢測血尿酸濃度。

1.5 統計學方法 采用SPSS 24.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內治療前后比較采用配對t檢驗；重復測量數據采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。圖的制作采用Graphpad Prism 8.0軟件。

2 結果

2.1 體質量 三組小鼠治療前體質量比較，差異無統計學意義（F=0.988，P=0.386），具有可比性；三組小鼠治療后體質量比較，差異亦無統計學意義（F=0.534，P=0.592）。三組小鼠治療后體質量與治療前比較，差異均無統計學意義（t配對值分別為1.84、1.163、0.714，P值分別為0.10、0.275、0.495），見圖1。

圖1 三組小鼠治療前后體質量比較Figure 1 Comparison of body weight in the three groups of mice before and after treatment

2.2 足掌厚度增長百分比 時間與方法在足掌厚度增長百分比上存在交互作用（F交互=49.83，P交互＜0.001）；時間、方法在足掌厚度增長百分比上主效應顯著（F時間=218.58、P時間＜0.001，F方法=332.79、P方法＜0.001）。三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比比較，差異有統計學意義（F值分別為 254.53、149.54、113.83、248.63、83.67、239.79、94.85、195.98，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比大于對照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長百分比小于溶劑組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2～3。

圖2 三組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比比較Figure 2 Comparison of increased percentage of hind paws thickness in the three groups of mice 6 hours after modeling and 1 to 7 days after treatment

圖3 三組小鼠造模后6 h及治療后7 d足爪腫脹的典型圖片Figure 3 Typical pictures of hind paw swelling 6 hours after modeling and 7 days after treatment in the three groups of mice

2.3 IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F值分別為55.97、341.63、340.88，P＜0.001）；溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量高于對照組（P＜0.01），DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量低于溶劑組，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖4 三組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量比較Figure 4 Comparison of relative mRNA expression quantities of IL-1β，TNF-α and iNOS in the injected hind paw tissues in the three groups of mice 7 days after treatment

2.4 血尿酸濃度 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異有統計學意義（F=23.11，P=0.002）；DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對照組、溶劑組，差異有統計學意義（P值分別為0.001、0.003），而對照組與溶劑組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較，差異無統計學意義（P=0.154），見圖5。

圖5 三組小鼠治療后7 d血尿酸濃度比較Figure 5 Comparison of serum uric acid concentration in the three groups of mice 7 days after treatment

3 討論

中醫學理論認為，AGA屬“痹證”范疇，又稱“歷節”或“白虎歷節”，其病因病機為先天稟賦不足，或后天調攝不慎、飲食不節、恣飲瓊漿或嗜肥甘無度，或傷于情志飲食致使脾胃功能失調、腎精損傷，加之外感風、寒、濕三氣而為病；AGA急性發作期以濕熱蘊結型為主［19-20］。當歸拈痛湯源自《醫學啟源》，是清熱利濕、疏風清熱的代表方，“治濕熱為病，肢節煩痛……遍身疼，下注于脛，腫痛不可忍”，方中羌活勝濕透關利節、防風溫散經絡中濕邪為君藥；升麻、葛根引陰中之陽上行而升散，白術和中除濕，蒼術去皮膚腠理之濕，為臣藥；當歸活血散瘀止痛，黨參、（炙）甘草補脾益氣護胃，苦參、黃芩、知母、茵陳泄濕熱、除肢節煩痛，豬苓、澤瀉滲濕化飲，共為佐藥；（炙）甘草兼調和諸藥而為使。臨床研究發現，當歸拈痛湯是治療濕熱內蘊型AGA的驗方，可有效減輕急性炎性反應，療效與塞來昔布、秋水仙堿相當［21-22］。

現代藥理學研究表明，澤瀉能降低大鼠血尿酸濃度，其作用機制可能與抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）活性、減輕腎臟損傷、下調腎臟中腎臟尿酸鹽轉運體1的表達有關［23］；葛根有效成分葛根素不僅可通過調節免疫細胞、炎性因子、信號通路等發揮抗炎作用，還可通過抑制XOD活性、促進尿酸排泄而降低血尿酸濃度，具有抗AGA作用［24］；黃芩有效成分黃芩苷可有效抑制大鼠的XOD活性［25］。

目前，MSU混懸液局部注射誘導是研究AGA最常用的動物造模方法［26］，大鼠、雞、家兔是研究AGA最常用的造模動物。為尋找更為經濟和理想的AGA動物模型，筆者所在課題組結合國外文獻［18，27］而嘗試建立了C57BL/6雄性小鼠足掌深層跖跗關節周圍注射MSU混懸液誘導的AGA動物模型，并已證實其外在體征、發病機制、病理改變等與人AGA相似［28］。本研究首次應用上述模型探究當歸拈痛湯治療AGA的療效和作用機制，結果顯示：溶劑組和DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～7 d足掌厚度增長百分比大于對照組，DGNTT組小鼠造模后6 h及治療后1～5 d、7 d足掌厚度增長百分比小于溶劑組，溶劑組和DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量高于對照組，DGNTT組小鼠治療后7 d注射足部組織IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA相對表達量低于溶劑組，DGNTT組小鼠治療后7 d血尿酸濃度低于對照組、溶劑組，表明當歸拈痛湯可有效緩解AGA小鼠足爪炎性腫脹程度，下調炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表達，降低血尿酸濃度。此外，本研究還對三組小鼠治療前后體質量進行了組間和組內比較，但均未發現顯著差異，提示造模方法及當歸拈痛湯對小鼠體質量無明顯影響，安全、可行。因此，筆者認為當歸拈痛湯可通過多方面作用（抗炎、調節炎性因子的表達、降尿酸）治療AGA，是能夠解決AGA多個核心問題的有效方劑且安全性較高。

作者貢獻：陳紹華負責實驗動物的飼養與處理，數據分析，論文撰寫與修改；陳紹華、梁倩倩對文章整體負責，監督管理；王沁筠、吳昌桂、趙嘯負責實驗動物取材、觀察指標測定、數據整理；徐浩負責圖像采集；施杞、梁倩倩負責研究的設計與可行性分析。

本文無利益沖突。