基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方對軟骨基質(zhì)的保護作用及其機制

鄢澤然，陳光耀，陳嘉琪，徐愿，羅靜，陶慶文*

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以軟骨結(jié)構(gòu)損傷為主要特征的退行性病變，與年齡、性別、遺傳因素、代謝因素及關(guān)節(jié)機械損傷等密切相關(guān)［1］。據(jù)統(tǒng)計，我國40歲以上人群OA發(fā)病率為46.3%，OA已成為導(dǎo)致我國老年人殘疾的主要原因之一［2］。目前，臨床常使用非甾體抗炎藥控制疼痛等OA癥狀，但胃腸道潰瘍等一系列不良反應(yīng)限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用［3-4］；氨基葡萄糖類藥物雖廣泛用于治療OA，但多項Meta分析結(jié)果表明其對OA的治療效果存疑［5］。因此，基于軟骨保護作用開發(fā)相關(guān)藥物以減少OA的發(fā)生或延緩OA的進展是OA研究熱點之一。

本研究價值：

目前，臨床尚缺乏有效治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）的手段。研究表明，骨痹通方對OA具有較好的臨床治療效果，對OA模型大鼠軟骨具有良好的保護作用，但其具體作用機制尚不明確。本研究通過白介素1β介導(dǎo)的SW1353軟骨肉瘤細胞建立OA細胞模型，發(fā)現(xiàn)骨痹通方可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的過度表達及Wnt/β-catenin通路異常激活而發(fā)揮軟骨基質(zhì)保護作用。

本研究局限性：

炎性因子刺激導(dǎo)致軟骨細胞釋放相關(guān)基質(zhì)水解酶類是導(dǎo)致OA的重要原因，但OA的發(fā)生還與軟骨細胞凋亡、自噬等因素密切相關(guān)，本研究為細胞實驗，今后需進一步開展臨床研究以探討骨痹通方治療OA的具體作用機制等。

既往研究表明，損傷關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨細胞與滑膜細胞會在相關(guān)炎性因子介導(dǎo)下釋放炎性遞質(zhì)及促進軟骨基質(zhì)水解的酶類，進而導(dǎo)致軟骨細胞外基質(zhì)降解及軟骨結(jié)構(gòu)損傷，炎性反應(yīng)與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6］。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類依賴Ca2+、Zn2+等金屬離子進行活化的酶，與細胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)，其中以膠原酶基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）及基質(zhì)溶解素酶基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）與OA關(guān)系最為密切，是OA發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子［7-9］。

骨痹通方為首都國醫(yī)名師閻小萍教授基于多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立的治療OA的有效方劑。一項隨機對照試驗結(jié)果顯示，骨痹通方與氨基葡萄糖類藥物相比能更有效地緩解和改善膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、僵硬癥狀及關(guān)節(jié)功能障礙［10］；另有動物實驗結(jié)果顯示，骨痹通方可有效預(yù)防通過Hulth法建立的大鼠OA模型的軟骨破壞，但其具體作用機制未明［11］。本研究于2020年6—9月完成，通過白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）介導(dǎo)的SW1353軟骨肉瘤細胞建立OA細胞模型，旨在基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方對軟骨基質(zhì)的保護作用及其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與試劑 SW1353軟骨肉瘤細胞（ATCC來源）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；Leibovitiz's L-15培養(yǎng)基（Gibco，美國），胎牛血清（ScienCell，美國），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTS）（Promga，美國），IL-1β（Peprotech，美國），MMP-1抗體（10371-2-AP，美國），MMP-3抗體（ab53015，Abcam，英國），MMP-13抗體（ab39012，Abcam，英國），β-catenin 抗體（ab32572，Abcam，英國），小鼠抗β-actin抗體（TA-09，中杉金橋，中國），山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記（ZB-5305，中杉金橋，中國），山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記（ZB-2301，中杉金橋，中國），10%變性預(yù)制膠（普利萊，中國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500，Promga，美國），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，TOYOBO，日本），Ripa裂解液（索萊寶，中國），甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（索萊寶，中國），HiPure Total RNA Mini Kit（美基，中國）；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由擎科生物科技合成，引物序列詳見表1；MMP-3酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試 劑 盒（R&D，USA），MMP-1、MMP-13 ELISA試劑盒（Novus Biologicals，USA）。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

1.2 骨痹通方藥物組成及制作方法 骨痹通方由骨碎補20 g、淫羊藿15 g、補骨脂15 g、杜仲30 g、狗脊30 g、土貝母20 g、青風(fēng)藤30 g、雞血藤30 g組成，使用前需對上述藥材進行清撿并粉碎成直徑為2～3 cm碎片，之后經(jīng)去離子水浸泡、提取、過濾得到含中藥成分溶液，最后離心除去雜質(zhì)并進行濃縮、干燥，備用；使用時加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）并根據(jù)實驗要求配置成濃度為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的骨痹通方溶液，注意使用除菌過濾器進行過濾。

1.3 細胞培養(yǎng)方法 將SW1353軟骨肉瘤細胞置于含90% Leibovitiz's L-15培養(yǎng)基、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素的完全培養(yǎng)基中，并密封放置于37 ℃孵箱。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 SW1353軟骨肉瘤細胞活力 采用MTS法檢測SW1353軟骨肉瘤細胞活力：將SW1353軟骨肉瘤細胞種植于96孔板中，每孔種植2萬個細胞，分別加入濃度為500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的骨痹通方溶液〔設(shè)置3個副孔和空白對照孔（骨痹通方溶液濃度為0）〕；使用封口膜進行密閉并置于37 ℃孵箱中孵育12 h后棄去培養(yǎng)基；使用PBS沖洗2次后置于Leibovitiz's L-15培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，并在每孔加入MTS 20 μl；1 h后將96孔板置于酶標(biāo)儀上并檢測490 nm波長處光密度（optical density，OD）值。將正常SW1353軟骨肉瘤細胞活力設(shè)定為100%，計算不同濃度的骨痹通方溶液干預(yù)后SW1353軟骨肉瘤細胞活力，計算公式：細胞活力（%）=（加入骨痹通方溶液孔OD值-培養(yǎng)基OD 值）/（空白對照孔OD值-培養(yǎng)基OD值）×100 ×100%。

1.4.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達情況 采用實時熒光定量PCR檢測MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達情況：將SW1353軟骨肉瘤細胞種植于6孔板中，每孔種植70萬個細胞，設(shè)置A組、B組、C組、D組、E組（每組設(shè)置兩個副孔），其中A組為空白對照，B組為陽性對照（加入10 μg/L的IL-1β），C組、D組、E組加入10 μg/L的IL-1β后分別加入低劑量（625 mg/L）、中劑量（1 250 mg/L）、高劑量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜進行密閉并置于37 ℃孵箱中孵育12 h，之后吸取培養(yǎng)基并使用PBS沖洗2次；按照試劑盒說明書，采用HiPure Total RNA Mini Kit試劑盒提取總RNA 1 μg并反轉(zhuǎn)錄形成cDNA；采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix 20 μl反應(yīng)體系進行PCR擴增，并計算MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量，即MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達量除以β-actin表達量。

1.4.3 MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-catenin蛋白表達情況 采用Western-blotting檢測MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-catenin蛋白表達情況：將SW1353軟骨肉瘤細胞種植于6孔板中，每孔種植70萬個細胞，設(shè)置A組、B組、C組、D組、E組（每組設(shè)置兩個副孔），其中A組為空白對照，B組為陽性對照（加入10 μg/L的IL-1β），C組、D組、E組加入10 μg/L的IL-1β后分別加入低劑量（625 mg/L）、中劑量（1 250 mg/L）、高劑量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜進行密閉并置于37 ℃孵箱中孵育12 h，之后依次加入Ripa裂解液進行裂解、加入上樣緩沖液并進行煮沸；使用10%變性預(yù)制膠進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至經(jīng)甲醇活化的聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上；封閉1 h后加入相應(yīng)的稀釋后的一抗（MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-actin稀釋濃度分別為 1∶2 500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000）并在4 ℃條件下過夜；使用TBST（Tris緩沖液+Tween-20）進行清洗并加入相應(yīng)的稀釋后的二抗，孵育1 h后再次使用TBST清洗，最后進行曝光。

1.4.4 MMP-1、MMP-3、MMP-13分泌情況 采用ELISA檢測MMP-1、MMP-3、MMP-13分泌情況：將SW1353軟骨肉瘤細胞種植于6孔板中，每孔種植70萬個細胞，設(shè)置A組、B組、C組、D組、E組（每組設(shè)置兩個副孔），其中A組為空白對照，B組為陽性對照（加入10 μg/L的IL-1β），C組、D組、E組加入10 μg/L的IL-1β后分別加入低劑量（625 mg/L）、中劑量（1 250 mg/L）、高劑量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液；使用封口膜進行密閉并置于37 ℃孵箱中孵育12 h后收集細胞培養(yǎng)液，10 000 r/min離心5 min（離心半徑5 cm）后取上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量，使用酶標(biāo)儀獲取每孔OD值，使用Curve Expert 1.4軟件及擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 4進行制圖與分析，采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析及Dunnett-t檢驗。雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SW1353軟骨肉瘤細胞活力 濃度為500、1 000、1 500、2 000、2 500 mg/L的骨痹通方溶液對SW1353軟骨肉瘤細胞活力未見明顯影響，但濃度為3 000 mg/L的骨痹通方溶液對SW1353軟骨肉瘤細胞活力有一定抑制作用（P＜0.05），見圖1，因此將2 500 mg/L作為骨痹通方溶液干預(yù)SW1353軟骨肉瘤細胞的最大濃度（高劑量），將最大濃度的0.50倍作為中劑量濃度，將最大濃度的0.25倍作為低劑量濃度。

圖1 不同濃度骨痹通方溶液對SW1353軟骨肉瘤細胞活力的影響Figure 1 Effect of different concentrations of Gubitong Recipe solution on viability of SW1353 chondrosarcoma cells

2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表達情況 五組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組、C組、D組、E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量高于A組，但C組細胞MMP-1、MMP-3 mRNA相對表達量低于B組，D組、E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量低于B組、C組，E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 五組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相對表達量Figure 2 Relative mRNA expression quantities of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the five groups of cells

2.3 MMP-1、MMP-3、MMP-13 蛋白表達情況 五組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組、C組、D組、E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量高于A組，但C組細胞MMP-1、MMP-3蛋白相對表達量及D組、E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量低于B組，D組細胞MMP-1、MMP-13及E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量低于C組，E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3～4。

圖3 五組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白電泳圖Figure 3 Electrophoresis of MMP-1，MMP-3，and MMP-13 protein in the five groups of cells

圖4 五組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相對表達量Figure 4 Relative protein expression quantities of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the five groups of cells

2.4 MMP-1、MMP-3、MMP-13 分泌情況 五組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組、C組、D組、E組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量高于A組，但C組、D組、E組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于B組，D組、E組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于C組，E組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 五組細胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量Figure 5 Contents of MMP-1，MMP-3，MMP-13 in the supernatant solution in the five groups of cells

2.5 MMP-13、β-catenin蛋白表達情況 分別在B組基礎(chǔ)上加入5 μmol/L Wnt/β-catenin通路激活劑WAY-262611溶液（F組）、10 μmol/L地塞米松溶液（G組）。七組細胞MMP-13、β-catenin蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組、C組、D組、E組、F組、G組細胞MMP-13、β-catenin蛋白相對表達量高于A組，F(xiàn)組細胞MMP-13、β-catenin蛋白相對表達量高于B組、C組、D組、E組、G組，但D組、E組、G組細胞MMP-13蛋白相對表達量及E組、G組細胞β-catenin蛋白相對表達量低于B組、C組，G組細胞MMP-13蛋白相對表達量及E組、G組細胞β-catenin蛋白相對表達量低于D組，G組細胞MMP-13、β-catenin蛋白相對表達量低于E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 6～7。

圖6 七組細胞MMP-13、β-catenin蛋白電泳圖Figure 6 Electrophoresis of MMP-13 and β-catenin protein in the seven groups of cells

圖7 七組細胞MMP-13、β-catenin蛋白相對表達量Figure 7 Relative protein expression quantities of MMP-13 and β-catenin in the seven groups of cells

3 討論

在機械刺激、炎性因子及自身衰老等因素作用下軟骨細胞基質(zhì)降解相關(guān)酶類釋放增多并導(dǎo)致軟骨基質(zhì)異常降解、軟骨結(jié)構(gòu)損傷是OA的主要發(fā)病機制［8］。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，骨痹通方對OA具有良好的臨床療效及較好的軟骨保護作用，但其具體作用機制尚不完全明確［6-7］。通過炎性因子IL-1β介導(dǎo)的SW1353軟骨肉瘤細胞建立OA細胞模型較直接使用人或動物軟骨細胞建立的OA模型具有穩(wěn)定、可重復(fù)性良好等優(yōu)點，是開展OA研究的經(jīng)典細胞模型。本研究結(jié)果顯示，B組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA、蛋白相對表達量及上清液含量高于A組，提示OA細胞模型復(fù)制成功；C組、D組、E組細胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA、蛋白相對表達量及上清液含量相較B組出現(xiàn)不同程度降低，提示骨痹通方對軟骨細胞基質(zhì)水解酶的合成與釋放具有一定抑制作用，對軟骨基質(zhì)具有一定保護作用且存在一定劑量依賴效應(yīng)，而抑制MMPs的過度表達可能是骨痹通方發(fā)揮軟骨基質(zhì)護作用的機制之一。

Wnt信號途徑指配體蛋白Wnt與相關(guān)膜蛋白受體結(jié)合后進一步激活多個下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；既往研究表明，Wnt/β-catenin通路的異常激活與纖維化、腫瘤、自身免疫炎性疾病等密切相關(guān)［12-14］，而Wnt信號激活后抑制細胞質(zhì)β-catenin蛋白降解并最終易位至細胞核中激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄是Wnt/β-catenin通路的經(jīng)典途徑［15］。研究表明，Wnt/βcatenin通路激活會通過促進軟骨細胞基質(zhì)水解酶類的表達而誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解，Wnt/β-catenin通路與OA患者軟骨特異性細胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)［16-18］，因而抑制Wnt/β-catenin通路可作為OA的潛在治療策略［16］。本研究結(jié)果顯示，B組細胞β-catenin蛋白相對表達量高于A組，提示OA細胞模型Wnt/β-catenin通路異常激活，與既往研究結(jié)果一致［19］；F組細胞β-catenin蛋白相對表達量高于B組，但E組、G組細胞β-catenin蛋白相對表達量低于B組，G組細胞β-catenin蛋白相對表達量低于E組，表明高劑量（2 500 mg/L）骨痹通方對Wnt/β-catenin通路異常激活有一定抑制作用，而聯(lián)用地塞米松可在一定程度上增強高劑量（2 500 mg/L）骨痹通方對Wnt/β-catenin通路異常激活的抑制作用，抑制Wnt/βcatenin通路異常激活可能是骨痹通方發(fā)揮軟骨基質(zhì)保護作用的機制之一。

綜上所述，骨痹通方對軟骨基質(zhì)具有一定保護作用且存在一定劑量依賴效應(yīng)，抑制MMPs的過度表達及Wnt/βcatenin通路異常激活可能是其發(fā)揮軟骨基質(zhì)保護作用的重要機制。

作者貢獻：鄢澤然負責(zé)文章的構(gòu)思、研究的設(shè)計、基金項目的申請；鄢澤然、陳光耀進行實驗操作；鄢澤然、陶慶文負責(zé)文章的質(zhì)量控制；陳光耀進行數(shù)據(jù)收集及論文撰寫；陳光耀、陳嘉琪進行統(tǒng)計學(xué)處理；陳嘉琪負責(zé)制圖；徐愿、羅靜指導(dǎo)實驗操作，負責(zé)數(shù)據(jù)核對；陶慶文負責(zé)文章的審校，對文章整體負責(zé)。

本文無利益沖突。