骨發育相關基因表達水平與鹿茸重量的相關性分析

趙佩,王洪亮,王磊,邢秀梅,胡鵬飛

(中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物重點試驗室，吉林 長春 130112)

鹿茸是自然界唯一能夠周期性完全再生的哺乳動物骨質附屬器官。除馴鹿雌、雄均生茸之外，只有雄鹿生茸，因此，鹿茸為鹿科動物的第二性征[1]。鹿茸是一種可以周期性再生的骨質器官，其成骨方式與典型的軟骨內成骨類似，但又有所不同。鹿茸軟骨是非常獨特的軟骨組織，它不僅在自然條件下能夠修復，而且每年以一種驚人的速度生長(可達2 cm/d)[2]。鹿茸生長頂端從遠端到基部分為真皮組織、間充質組織、前成軟骨組織、過渡組織和軟骨組織[3]。鹿茸生長的本質就是在軟骨骨架上的成骨過程，因此，鹿茸的生長與骨發育相關基因的表達密切相關。

MMP14是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中的成員。MMPs是指一系列在生理情況下可降解細胞外基質及基底膜的鋅離子依賴性內肽酶的家族總稱[4]。MMPs可分為膠原酶、明膠酶、基質酶、膜型基質金屬蛋白酶(MT-MMP)和其他5種亞型， MMP14屬于MT-MMP[5]。有研究表明MMPs在軟骨生長及成熟中發揮著重要的作用，MMPs通過對ECM降解和重塑,促進血管間充質浸潤,保證了軟骨內成骨的有序演進，同時某些MMPs在骨的發育中還發揮著將膠原前體轉變為成熟膠原的作用[6-7]。MMPs尤其MMP14作為軟骨骨化的重要影響因子,受到了很大關注。Ⅰ型膠原α2基因(COL1A2)是編碼I型膠原蛋白的主要基因[8]。Ⅰ型膠原是骨基質中含量最多的蛋白，占骨基質有機物的80%～90%，構成骨組織的蛋白框架，是鈣鹽沉著以及細胞附著的支架，其合成分泌是骨組織形成的先決條件，是成骨細胞分化最早的標志[9]。COL11A1基因編碼Ⅺ型膠原α1鏈,Ⅺ型膠原蛋白是是軟骨特異性細胞外基質蛋白，在細胞外基質中起重要的作用，Ⅺ型膠原參與其他軟骨特異性膠原(Ⅱ型和Ⅸ膠原)的纖維形成，并參與調節軟骨膠原纖維的直徑[10]。SPARC(secreted protein, acidic and rich in cysteine)，又稱作骨連接蛋白(osteonecfin)、基底膜40 蛋白(BM40)，是一種富含半胱氨酸(Cys)的酸性分泌蛋白，最早是從骨中分離出來的[11]。研究表明 SPARC 是一種成骨相關蛋白，與鈣離子有高度親和力，可以使得骨基質進一步鈣化，對于骨組織維持和重建是必需的[12]。PHOSPHO1(phospho ethanol amine/磷酸膽堿磷酸酶) 是磷酸脫氫酶家族的成員，參與無機磷酸鹽的生成，最初是從雞肥大生長板軟骨細胞中克隆出來的，在骨礦化中起到核心作用，PHOSPHO1通過其底物磷膽堿(PCHO)和磷乙醇胺(PEA)的水解釋放無機磷(PI)，用于骨骼礦化[13]。RHOA蛋白是一種23 kDa 的單體小G蛋白，由193個氨基酸組成,具有N端與C端2個結構域[14-15],屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，為GTP家族中重要成員，是GTP酶之一，參與細胞有絲分裂、細胞骨架調節等多種生物體內的生理過程[16]。CTNNB1基因全長23.2 kb，有16個外顯子，編碼β-catenin蛋白，其編碼的β-catenin蛋白含781個氨基酸[17-18]。Wnt/β-catenin信號通路被稱為Wnt信號通路的經典途徑[19]，在調控骨的形成與改建過程中發揮了重要作用，調控骨組織中包括成骨細胞、軟骨細胞及破骨細胞的分化、增殖，控制間充質細胞凝聚、軟骨內骨化作用啟動等過程的調控[20-22]。

目前國內外關于鹿茸生長的調節研究很多，鹿茸的快速生長受到一系列相關分子的嚴格調控，在鹿茸生長發育過程，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，甲狀旁腺素相關肽(PTHrp)、視黃酸(RA)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子(TGF)、神經生長因子(NGF)和骨形成蛋白(BMP)等起重要的調節作用。但目前關于鹿茸中與骨發育相關基因表達的研究鮮有報道。因此，本試驗用熒光定量PCR方法檢測不同重量鹿茸中與骨發育相關基因的表達情況，為鹿茸生長發育相關基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

試驗所需梅花鹿鹿茸為二杠茸，均采自中國農業科學院特產研究所中心鹿場，依據同一鋸別、相同生長天數、鹿茸重量不同，分為低重量和高重量兩組，每組3個。參照 Li等[23]對赤鹿生長頂端的分層方法，分別切取前軟骨層和軟骨層組織，液氮研磨為細粉，迅速轉移至液氮中凍存。

1.2 主要試劑及儀器

RNA Extraction Kit、PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit、SYBR?PremixExTaqTMKit均購自TaKaRa公司。 LightCycler?480熒光定量PCR儀。

1.3 總RNA的提取

按照TRIzol試劑的說明提取組織總RNA,使用Nanodrop2000微量分光光度計測定RNA樣品的OD值(260 nm吸光度值與280 nm吸光度值之比，反映核酸的純度)和濃度(ng/μL)，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統檢測RNA的完整性。

1.4 cDNA合成

反轉錄體系20 μL:RNA模板1 μL，OligodT1 μL，RNase Free ddH2O 11 μL，65 ℃加熱10 min后立即置于冰上冷卻，冰浴后離心數秒，向反應管中繼續添加以下試劑：5×RT Buffer 4 μL, Inhibitor 0.5 μL, 10 × dNTP Mixture 2 μL,反轉錄酶0.5 μL，在反應管中將試劑小心混勻并輕度離心；反轉錄PCR反應程序：55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，置于冰上終止反應。全程操作在冰上進行。將反轉錄產物，用持家基因GAPDH進行PCR檢測。將符合標準的cDNA產物于-20 ℃保存,以用于檢測目的基因的表達。

1.5 引物設計與合成

以管家基因GAPDH為內參[24]，用Primer Premier 5引物設計軟件設計引物，引物序列見表1。引物由上海生物工程股份有限公司合成。將引物用滅菌超純水溶解，稀釋為10 μmol/L，-20 ℃保存。

表1 熒光定量RT-PCR 目的基因引物的相關信息

1.6 實時熒光定量PCR擴增

分別擴增MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因，檢測引物特異性。PCR反應體系：總體積25 μL，其中cDNA模板1 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，0.5 U/μLTaqDNA聚合酶,上、下游引物各0.5 μL，滅菌去離子H2O 17.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。采用SYBR Green I熒光染料法對組織中MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因mRNA進行相對定量分析，PCR反應體系：cDNA模板2 μL，FastStar Essential DNA Green Master 10 μL, 上、下游引物各1 μL，RNase Free ddH2O 6 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 變性10 s, 60 ℃退火10 s,72 ℃延伸20 s；循環40次后進行溶解曲線分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，然后以每10 s上升1 ℃的速率從65 ℃升高到95 ℃。每個樣品重復3次。采用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析，計算目的基因與看家基因的相對表達量。

1.7 生物信息學分析

利用STRING軟件對骨發育相關基因表達互作進行分析，同時應用Cytoscape軟件制作骨發育相關基因參與生物學過程模式圖。

1.8 統計分析

采用獨立樣本t檢驗對不同重量鹿茸尖端組織骨發育相關基因表達進行顯著性檢驗，采用Pearson相關法分析骨發育相關基因表達水平與鹿茸重量之間的相關性，所有數據用SPSS 13.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同組別鹿茸重量比較

不同組別鹿茸重量比較結果發現，低重量組和高重量組鹿茸重量分別為(1.49±0.12)kg和(3.32±0.21)kg，存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 提取的樣品總RNA檢測

提取出的樣品總RNA在質量分數1%瓊脂糖凝膠上的電泳結果見圖1。

1～3. 高產組個體；4～6. 低產組個體

由圖1可以看到28S、18S RNA條帶明亮，且2條帶的亮度比值接近2∶1，表明所提取的總RNA完整性較好，濃度和純度可以滿足后續試驗要求。

2.3 普通PCR擴增結果分析

以逆轉錄后的cDNA為模板，通過普通PCR擴增目的基因和內參基因片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖2，GAPDH、MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC和CTNNB1基因的PCR產物電泳條帶顯示，引物擴增目的條帶單一，大小與預期結果一致，說明引物設計合理，同時cDNA未受到基因組DNA的污染，可以作為后續試驗模板使用。

M. DL500 Marker；1.GAPDH；2.MMP14；3.COL11A1；4.PHOSPHO1；5.RHOA；6.COL1A2；7.SPARC；8.CTNNB1

2.4 不同鹿茸重量組尖端組織生長發育相關基因表達量比較

通過實時熒光定量PCR技術對MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因進行了表達量的測定，結果如圖3。高重量組MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC和CTNNB1基因的mRNA相對表達量都顯著高于低重量組(P<0.01或P<0.05)。

2.5 骨發育相關基因表達量與鹿茸重量的相關分析

骨發育基因表達水平與鹿茸重量的相關系數研究結果顯示，MMP14基因表達水平與鹿茸重量相關系數為0.947，呈極顯著正相關(P<0.01);COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因表達水平與鹿茸重量相關系數依次為0.846、0.904、0.849、0.819、0.859、0.902，呈顯著正相關(P<0.05)。

2.6 鹿骨發育相關基因生物信息學分析

利用STRING工具查詢分析，結果如圖4所示，在動物機體中MMP14、COL11A1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因之間可能存在相互作用關系。

注：SRP表示低重量組的間充質層和前成軟骨層；LRP表示高重量組的間充質層和前成軟骨層。*P<0.05，**P<0.01A. MMP14;B. COL11A1;C. RHOA;D. PHOSPHO1;E. COL1A2;F. SPARC;G. CTNNB1

圖4 骨發育相關基因表達互作模式

利用生物信息學，初步研究COL11A1、COL1A2、MMP14、SPARC、RHOA、CTNNB1基因主要參與的生物學過程。圖5表明：COL11A1主要參與胚胎骨骼發育、組織發育和軟骨內骨化等生物學過程；COL1A2主要參與胚胎骨骼發育等生物學過程；MMP14主要參與胚胎骨骼發育、骨骼發育、組織發育和軟骨內骨化等生物學過程；SPARC主要參與胚胎骨骼發育、骨骼發育和軟骨內骨化等生物學過程等生物學過程；RHOA主要參與胚胎骨骼發育、骨骼發育、組織發育和軟骨內骨化等生物學過程。CTNNB1主要參與胚胎骨骼發育。綜上，COL11A1、COL1A2、MMP14、SPARC、RHOA和CTNNB1共同參與生物機體的骨骼發育及軟骨內骨化。

圖5 骨發育相關基因參與生物學過程模式圖

3 討論

本試驗用實時熒光定量PCR法對不同重量鹿茸尖端組織中與骨發育相關基因的mRNA相對表達量進行分析。李劍[7]研究表明MMP14缺乏，可使成骨細胞無法參與軟骨骨化。另有證據表明MMP14缺失的鼠體中次級骨化中心的出現延遲[25]。這些研究表MMP14的低表達可能會造成軟骨細胞增殖受限，延遲軟骨骨化。本試驗對比不同重量鹿茸中MMP14的表達量，發現其表達量與鹿茸重量呈極顯著正相關，表明鹿茸中MMP14基因的高表達可能促進軟骨細胞成熟骨化，進而有利于鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

研究表明Ⅰ型膠原的表達與骨骼生長發育密切相關。Hikita等[26]研究發現Ⅰ型膠原可以抑制成骨細胞增殖，促進成骨。王艷雙等[27]對梅花鹿鹿茸Ⅰ型膠原對大鼠成骨細胞的影響及其分子機制的研究，發現Ⅰ型膠原過表達可以抑制成骨細胞增殖，促進成骨細胞的分化、成熟。有研究表明加速Ⅰ型膠原合成分泌可以起到促進骨組織礦化的作用[28-29]。這些研究表明Ⅰ型膠原高表達可以抑制成骨細胞增殖，促進成骨細胞的成熟分化。本試驗對比不同重量鹿茸中COL1A2的表達量，發現在高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量組，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中COL1A2基因的高表達可能促進成骨細胞的成熟骨化，進而促進鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

Emma等[30]研究報道COL11A1基因 mRNA 的合成和穩定性降低可能會引發骨軟骨疾病。Ⅺ型膠原蛋白的低表達會抑制軟骨細胞的分化、成熟，造成軟骨發育不健全。本試驗對比不同重量鹿茸中COL11A1的表達量，發現在高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中CO11A1基因的高表達可能促進軟骨細胞成熟骨化，進而增大生長期鹿茸的重量。

研究表明，RHOA/ROCK 信號通路通過改變細胞骨架，進一步影響成骨分[31]。Takeshita等[32]在鼠的關節炎模型中發現 RHOA/ROCK 信號通路可以改變關節軟骨細胞骨架，從而導致關節軟骨細胞退變。本試驗對比不同重量鹿茸中RHOA的表達量，發現高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中RHOA基因的高表達可能會改變軟骨細胞骨架，利于成骨細胞成熟骨化，增加鹿茸重量。

有證據表明PHOSPHO1特異性表達于骨和軟骨的礦化部位，在成骨細胞系中高度表達，其產生礦化基質，有助于骨骼的礦化[13]。Macrae等[33]研究發現非PHOSPHO1小雞的骨骼礦化受到顯著抑制，不利于長骨的形成，說明PHOSPHO1的低表達抑制成骨細胞的成熟、骨化。本試驗對比不同重量鹿茸中PHOSPHO1的表達量，發現在高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中PHOSPHO1基因的高表達可能促進成骨細胞成熟骨化，以促進鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

有研究表明，SPARC會使骨生成增加，脂肪生成減少[34]。Sharma等[35]研究發現非SPARC小鼠成骨能力顯著下降主要表現為成骨細胞數目減少，進而骨軟化，提示SPARC在維持成骨細胞增殖過程中起重要作用。張然然等[36]研究發現SPARC在鹿茸的快速生長與快速骨化過程中起著重要的作用。這些研究表明SPARC低表達會抑制成骨細胞的增殖，導致成骨作用減弱，進而出現骨軟化。本試驗對比不同重量鹿茸中SPARC的表達量，發現在高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中SPARC基因的高表達可能會促進成骨細胞增殖，進而加速鹿茸骨化，增加鹿茸的重量。

WNT信號通路調控著成骨細胞分化并且在已分化的成骨細胞中調控著骨形成。Glass等[37]研究表明，在已分化成骨細胞中穩定表達的beta-catenin信號，引起骨量的增加，而其表達信號的降低導致骨量減少。Mount等[38]對經典的Wnt信號通路在鹿茸生長過程進行研究，β-catenin通過Wnt信號通路在調節鹿角祖原細胞存活及凋亡中發揮重要的調節作用，并且對骨形成具有一定調節作用。這些研究表明高表達的CTNNB1會促進成骨作用。本試驗對比不同重量鹿茸中CTNNB1的表達量，發現在高重量鹿茸中表達量要顯著高于低重量，且表達量與鹿茸重量呈顯著正相關，表明鹿茸中CTNNB1基因的高表達可能會促進成骨細胞分化，加強鹿茸成骨作用，增加鹿茸的重量。

4 結論

本研究通過比較高低重量組鹿茸尖端骨發育相關基因的表達，發現MMP14、COL11A1、PHOSPHO1、RHOA、COL1A2、SPARC、CTNNB1基因的表達存在顯著差異，且骨發育相關基因表達與鹿茸重量呈顯著正相關。據此推測，骨發育相關基因的高表達可能會促進軟骨細胞分化、成熟，加速鹿茸骨化，以形成結實的密質骨，從而使鹿茸角重量增加。