3株不同血清型沙門菌感染ICR小鼠模型的建立

左庚亮，馬喆

(南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095)

沙門菌是一類重要的食源性病原微生物，該病原血清型眾多，能夠導致腸熱、食物中毒及急性敗血癥等多種疾病，給公共衛生和養殖業發展造成重大危害[1]。歐盟最新研究報告指出，有1/5的食源性疾病由沙門菌感染引起，將近一半的成員國仍飽受沙門菌的困擾[2]。我國畜禽養殖環境中沙門菌的污染情況嚴重，在“限抗令”背景下，愈發成為危害餐桌和養殖產業的重大隱患，迫切需要開發針對不同血清型沙門菌的疫苗和非抗生素類藥物等產品，為沙門菌的防控和凈化工作助力，而建立可用于評價抗沙門菌疫苗和藥物效果的動物模型是實驗室產品試制階段的關鍵性基礎工作。

不同血清型的沙門菌對宿主的適應性有所不同，適宜的動物模型是研究沙門菌生理功能、發病機制和病理損傷的關鍵。研究人員已經建立了包括小鼠、雛雞、果蠅和斑馬魚等多種模型[3-6]。其中小鼠由于與人類基因同源性較高、適應性強、繁殖率高和遺傳性狀穩定等優勢，被廣泛用于沙門菌致病機制的相關研究[7]。小鼠腸道感染模型確立的過程中受到諸多因素如小鼠品系、細菌的血清型、菌株毒力和攻毒途徑等影響，直觀體現在小鼠對細菌感染劑量響應上的差異[8]。以6周齡BALB/c小鼠為實驗模型，鼠傷寒沙門菌ATCC14028灌胃攻毒后,測得半數致死量為1.4×105CFU[9]。然而以昆明鼠為實驗模型，口腔灌胃鼠傷寒沙門菌STM50115，半數致死量為4×108CFU；相同品系小鼠下，以鼠傷寒沙門菌SL1344進行口腔攻毒，測得半數致死劑量為2.3×104CFU[10-11]。由此可見，已建立的小鼠模型僅適用于特定血清型的沙門菌，在研究沙門菌感染機制時應結合實際情況，建立滿足自身實驗需求的小鼠感染模型。

本研究旨在分別用臨床分離的動物源雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌腹腔感染ICR小鼠，根據不同劑量感染下小鼠的存活曲線，組織細菌載量和組織病理學變化來評價沙門菌對小鼠的致病性，以便建立我國臨床常見的畜禽源不同血清型沙門菌株感染ICR小鼠模型，為研究沙門菌發病機制和沙門菌疫苗及藥物的開發提供動物模型基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞白痢沙門菌CVCC1800購自中國獸醫藥品監察所，鼠傷寒沙門菌CVCC542和腸炎沙門菌ATCC19585購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，SPF級4～6周齡ICR雌鼠購自南京青龍山動物繁殖場。

1.2 沙門菌最適感染劑量的確定

3株不同血清型的沙門菌平板劃線后置于溫箱中過夜培養。次日用接種環刮取平板上的全部菌落，分別接種到含有50 mL新鮮LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養至OD600值約為0.6。菌體離心后用無菌的PBS洗滌重懸3次，根據表1的試驗方案將菌液調整至合適的稀釋度。將4～6周齡ICR雌鼠隨機分組，每組3只。攻毒后給予充足的水和飼料，每天觀察小鼠的生存狀況并繪制存活曲線。

表1 3株不同血清型沙門菌的小鼠攻毒模型確立方案

1.3 沙門菌感染小鼠后臟器的細菌載量檢測

小鼠感染沙門菌20 h后全部處死。剖檢后摘除脾臟、肝臟、空腸、回腸和盲腸部位以檢測細菌載量。腸道部分的摘取如圖1所示。

圖1 小鼠腸道部分摘取

向2 mL的滅菌勻漿管(含鋼珠)中加入1 mL的PBS緩沖液，擰好蓋子后稱重，記作管的初始重量。將摘取的小鼠臟器置于勻漿管中，擰好蓋子再次稱重。2次稱重的數值相減，即為待檢組織的重量。將勻漿管放入組織勻漿儀中，勻漿結束后置于4 ℃冰箱中備用。

96孔板每孔中加入180 μL的PBS緩沖液，取出勻漿管在渦旋儀上振蕩10 s后，擰開蓋子吸取20 μL進行10倍比稀釋，稀釋度依次記為10-1～10-6，并進行菌落計數。

1.4 沙門菌感染小鼠后臟器的組織病理學變化

分別用不同血清型的沙門菌對小鼠進行攻毒，攻毒20 h后處死。摘取脾臟、肝臟、空腸和回腸等部位，浸泡于10%的福爾馬林中固定。樣品由武漢賽維爾生物科技有限公司制作病理學組織切片。

2 結果

2.1 沙門菌最適感染劑量的確定

攻毒后每隔12 h觀察小鼠狀態及存活情況(圖2)。各組小鼠均表現出不同程度的精神萎靡、被毛粗亂等臨床癥狀。對于雞白痢沙門菌，當攻毒劑量為5.6×108CFU及以上時，組內所有小鼠在48 h內陸續死亡；當攻毒劑量為5.6×107CFU時，2只小鼠在108 h內陸續死亡，剩余1只小鼠耐過后康復；當攻毒劑量低于5.6×107CFU時，組內小鼠無死亡現象。對于腸炎沙門菌，當攻毒劑量為3.2×108CFU及以上時，組內小鼠在24 h內陸續全部死亡；當攻毒劑量為3.2×107CFU時，組內小鼠在156 h內陸續死亡；當攻毒劑量低于3.2×107CFU時，組內小鼠無死亡現象。對于鼠傷寒沙門菌，當攻毒劑量為2.5×106CFU時，組內小鼠在72 h內陸續全部死亡；當攻毒劑量為2.5×105CFU時，組內小鼠在96 h內陸續死亡；當攻毒劑量為2.5×104CFU時，組內小鼠無死亡。由此可知，雞白痢沙門菌CVCC1800、腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542對小鼠的最適感染劑量分別為5.6×108、3.2×107和2.5×106CFU。在最適感染劑量下，小鼠無急性死亡的情況發生，有充足的時間觀察小鼠的狀態，適合疫苗和藥物的臨床效果評估。

A、B、C對應的沙門菌血清型依次為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌

2.2 沙門菌感染小鼠后臟器的細菌載量檢測

3株沙門菌感染小鼠的部位及感染量略有差異(圖3)。雞白痢沙門菌主要感染小鼠的腸道部分，空腸的細菌載量約為2.7×108CFU/g，回腸細菌載量約為6.7×108CFU/g,顯著高于脾臟和肝臟的細菌載量約104CFU/g。腸炎沙門菌感染小鼠的部位較為廣泛，脾臟載量高于其他臟器，約為7.4×107CFU/g。肝臟細菌載量約為4.9×106CFU/g，腸道部位的細菌載量區間在106～107CFU/g。鼠傷寒沙門菌在小鼠的各臟器均有分布，但細菌載量差異不顯著。

A、B、C對應的沙門菌血清型依次為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌

2.3 沙門菌感染小鼠后臟器的組織病理學變化

雞白痢沙門菌CVCC1800感染小鼠后，空腸黏膜層結構輕微受損，部分腸絨毛斷裂(圖4A)；回腸受損嚴重，黏膜層細胞大量壞死脫落，無法辨別正常結構(圖4B)。腸炎沙門菌ATCC19585感染小鼠后，脾臟出現炎性細胞浸潤(圖4C)，肝臟組織出現大量空泡病變(圖4D)。鼠傷寒沙門菌CVCC542感染小鼠后，脾臟也出現炎性細胞浸潤的現象(圖4E)，肝臟組織中部分肝細胞固縮，且肝索走向不明顯(圖4F)。

A和B分別為小鼠感染雞白痢沙門菌CVCC1800的空腸和回腸組織病變(100×)；C和D分別為小鼠感染腸炎沙門菌ATCC19585的脾臟和肝臟組織病變(400×)；E和F分別為小鼠感染鼠傷寒沙門菌CVCC542的脾臟和肝臟組織病變(400×)

3 討論

小鼠由于遺傳背景清晰及成本低廉而被廣泛用于沙門菌的相關研究。針對不同來源沙門菌，根據研究的對象和目的不同，應該重新評判小鼠模型在評價沙門菌感染情況時的適用性。王偉等[8]將不同劑量的腸炎沙門菌標準菌株SE50336通過口腔灌注的方式感染6周齡ICR雌鼠，最終測定半數致死量LD50為1×104.67CFU；姚營等[12]以昆明小鼠為模型，用鼠傷寒沙門菌灌胃攻毒，通過觀察攻毒后小鼠的腸道組織病變，小腸上皮細胞超微結構變化和腸道淋巴細胞增殖狀況，初步探索了鼠傷寒沙門菌引發腸炎的發病機制和病理生理。而本研究將腸炎沙門菌ATCC19585和鼠傷寒沙門菌CVCC542腹腔接種到ICR雌鼠體內，測得其最適感染劑量分別為3.2×107CFU和2.5×106CFU，感染后小鼠出現精神萎靡、采食減少及不愿活動等癥狀，脾臟出現炎性細胞浸潤，肝臟組織出現大量空泡病變。這與上述動物模型感染劑量和病理變化上略有差異，差異可能與小鼠品系和菌株毒力有關。

雞白痢沙門菌具有高度的宿主專嗜性，主要感染雞和火雞。因此特定品系的SPF雞如白來航雞(White Leghorns)、羅德島紅雞(Rhode Island Red)和溫多特雞(White Wyandottes)等來被用于雞白痢沙門菌的研究[13-14]。本研究用雞白痢沙門菌標準株CVCC1800腹腔感染小鼠，測得最適感染劑量為5.6×108CFU，這也是將ICR小鼠作為雞白痢沙門菌的模式動物的首次嘗試。相較于腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌引起的雞局部感染或腸炎癥狀，雞白痢沙門菌可引起全身性感染[15]。但從本試驗獲得的細菌載量上看，雞白痢沙門菌主要感染小鼠的空腸和回腸，其次為盲腸。脾臟和肝臟中細菌載量較低，與感染劑量相比，細菌在小鼠肝臟脾臟中的定殖效果并不理想。

本研究建立了雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的ICR小鼠腹腔感染模型，其中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌小鼠感染模型效果較好，雞白痢沙門菌由于宿主嗜性差異，在小鼠臟器中的定殖效果并不理想。本研究建立的小鼠模型為探究這3株不同血清型畜禽源分離沙門菌的致病機制提供模型參考，并為抗沙門菌疫苗和藥物的評價奠定基礎。