手工克隆生產豬胚胎關鍵技術的改進研究

陶瑞鑫，賈超，武恩在，李娟*

(1.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；2.淮安市南農大新農村發展研究有限公司，江蘇 淮安 223005)

體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer, SCNT)是生產克隆動物的一項核心技術。該技術將已分化的體細胞與去核卵母細胞胞質進行融合，經過一系列改變，供體染色質組織特異性的基因修飾信息將被擦除，并接受卵母細胞胞質內的信息表現出一種新的轉錄模式[1]。所得重構胚胎在體外完成激活和早期發育后移植入受體母畜子宮內，繁殖出具有相同基因型后代。早在2000年，科學家利用成年豬體細胞成功獲得第一例SCNT克隆仔豬[2]。同樣使用豬耳皮膚細胞作為供核體細胞，通過SCNT培育出萊蕪豬克隆后代，為地方豬保種及育種提供了新途徑[3]。近期為了應對非洲豬瘟疫情對地方豬遺傳資源的威脅，利用SCNT已成功獲得純種青峪豬仔豬[4]。SCNT還可與CRSPR/Cas9技術結合，獲得基因編輯克隆豬[5]。因此，SCNT技術在豬的種質資源保護、異種移植及疾病動物模型等領域具有較好的科學意義和應用前景。

雖然利用SCNT技術相繼獲得了羊、豬、猴等哺乳動物克隆后代[6-8]，但受多種因素的影響，豬的克隆效率依舊相對較低[9]。影響克隆胚胎發育效率的因素較多，包括SCNT的技術方法、卵母細胞、供核細胞的質量等。其中，作為受體細胞質的去核卵母細胞則是影響重構胚胎發育能力的一個重要因素，因為卵母細胞細胞質中儲存著大量mRNA、蛋白質、營養物質及發育相關因子等支持重構胚胎早期發育的主要物質[10-11]。另外，去核卵母細胞胞質為體細胞恢復多能性及重構胚胎的重編程提供了微環境[12]，重構胚胎順利完成重編程后才能獲得正常發育的能力，一旦胚胎重編程失敗或者重編程不完全均會阻礙克隆胚胎的發育[13-14]。研究報道，由于不完全去核導致的重組胚胎染色體的非整倍性或多倍體性，可直接導致早期克隆胚胎發育失敗[15-16]。因此，如何高效去除卵母細胞的細胞核，并減少卵母細胞胞質的損失，從而獲得較高質量的受體胞質與供核細胞完全融合，生產重構豬克隆胚胎，都是SCNT技術中的關鍵環節。雖然在不同物種中，已探索出幾種常用的去核方法，包括借助顯微操作儀的盲吸法、擠壓法、點壓法、Spindle-view系統去核法，以及使用切割刀完成去核的半卵法[17-20]，但不同去核方法的去核效率及對卵母細胞的損傷均有所不同。另外，豬卵母細胞具有脂滴含量高[21]、胞質顏色較暗這一特性，因此應用Spindle-view系統觀察豬卵母細胞內的紡錘體, 從而顯示MII期染色體所處位置進行去核比較困難，該方法更多用于小鼠、人的卵母細胞去核[22-23]。

目前，2種SCNT技術被廣泛用于生產克隆豬，即傳統顯微操作核移植技術(traditional cloning, TC)和手工克隆技術(handmade cloning, HMC)。HMC與TC在去核、融合及胚胎培養等操作過程采用的方法不同。HMC一定程度降低了操作難度和生產成本[24-25]，且已成功利用該技術先后獲得鼠、牛、豬等不同物種的克隆后代，并具有相對更高的生產率[26-29]。但值得注意的是，HMC是一種純手工的技術，操作人員的操作準確性對克隆胚胎的生產效率至關重要[30]。本研究將詳細闡述利用HMC生產豬克隆胚胎的核心技術路線和操作方法，同時對卵母細胞透明帶消化時間、卵母細胞去核方法以及重構胚胎體外培養3個關鍵步驟展開研究，為手工克隆操作人員提供具有參考價值的實用建議，以更好地掌握HMC技術，提高生產克隆胚胎效率和質量。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的采集及體外成熟

從屠宰場采集卵巢，清洗干凈后置于含生理鹽水的37 ℃保溫瓶中4 h內運送到實驗室。用10 mL一次性注射器抽取2～6 mm卵泡內的卵泡液，并將卵泡液注入50 mL離心管中，置于38.5 ℃的熱臺上沉淀15～20 min。用一次性滴管吸棄上層卵泡液，向沉淀中加入適量洗卵液ASP(添加2%胎牛血清(FBS)的緩沖溶液)輕輕吹打混勻，取適量于35 mm培養皿中。在體視顯微鏡下觀察，撿出胞質均勻并帶有至少3層卵丘細胞的卵丘卵母細胞復合物(COCs)進行體外成熟培養。取400 μL體外成熟培養液IVM(0.8 mmol/L L-GlutaMAX，10%(V/V)豬卵泡液(PFF)，10%(V/V)FBS，15 IU/mL PMSG，15 IU/mL HCG溶于TCM-199)于四孔板中，同時覆蓋400 μL無菌石蠟油，每孔放入50～60枚COCs于38.5 ℃、5% CO2以及飽和濕度的培養箱中進行體外成熟培養。

1.2 供體細胞準備

HMC開始前1周解凍豬胎兒成纖維體細胞，于DMEM培養基(添加10% FBS)、37 ℃、5% CO2以及飽和濕度培養。每3～4 d更換1次培養基，直至細胞匯合并鋪滿整個培養孔。HMC操作開始后，于37 ℃用0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)消化細胞約3 min后加入兩倍體積培養基終止消化，并將細胞懸液移入1.5 mL離心管，572g離心3 min，棄上清后加入T2(添加2% FBS的TCM-199)使細胞重新懸浮，置于室溫等待融合。

1.3 消化透明帶

半卵法切割去核時，需消化卵母細胞透明帶(zona pellucida, ZP)。首先使用1.0 mg/mL透明質酸酶(Hya)將體外成熟培養42～44 h的COCs外周卵丘細胞去除，置于操作液滴T2中洗凈后挑選出胞質均勻且排出PB1卵母細胞(圖1A)。隨后將卵母細胞轉移至3.3 mg/mL鏈蛋白酶(Pro)中消化ZP(圖1B)。

1.4 卵母細胞切割去核

待卵母細胞透明消化后，迅速將卵母細胞依次放入T2滴、T20滴(添加20% FBS的TCM-199)中各漂洗2次后轉移至切割液TPCB(2.5 μg/mL細胞松弛素CB的T2)，用自制顯微切割刀沿與極體垂直的方向將卵母細胞一分為二(圖1C)，一半為含PB1和約1/3(不超過1/2)胞質的半卵(圖1D)，另一半為無極體卵母細胞胞質作為無核半卵受體移入T2滴中待融合。

1.5 體細胞融合與電激活

豬的HMC采用2次電融合方法。第一次融合前，無極體半卵轉移至1 mg/mL的植物凝集素(PHA)中平衡2～3 s，隨后移入提前預平衡體細胞的T2滴中，以一對一的方式將卵母細胞和體細胞黏連在一起，移入融合液滴F0(含0.3 mol/L甘露醇，1 mg/mL聚乙烯醇)中平衡。在0.06 kV/cm的交流電(AC)下將半卵-體細胞垂直排列于電極間距為0.5 mm融合槽的電極金屬絲上(圖1E)，用0.2 kV/cm，9 μs的直流電電擊1次。完成第一次電融合的半卵-體細胞于T2液滴中靜置約1 h。挑選體細胞完全融入的半卵，進行第二次電融合。隨機取無核半卵與已融合的半卵-體細胞垂直排列于覆蓋有F+激活液(含0.3 mol/L甘露醇，1 mg/mL聚乙烯醇，0.1 mmol/L MgSO4，0.05 mmol/L CaCl2)的融合槽的電極金屬絲上(圖1F)，用0.86 kV/cm，80 μs的直流電電擊1次完成第二次融合和電激活，半卵-體細胞-半卵移入T2滴中恒溫孵育15 min，觀察融為一個完整的球型重構胚后(圖1G)，進行隨后的化學激活。

1.6 重構胚胎化學激活與體外培養

將重構胚胎轉移至PCC(5 μg/mL細胞松弛素B(CB)和10 μg/mL放線菌酮(CHX)的PZM-3)化學激活液中，置于38.5 ℃、5% CO2以及飽和濕度的培養箱中4 h。完成化學激活后，對無透明帶的HMC重構胚，采用微孔技術(well of wells，WOWs)于38.5 ℃、5% CO2、20% O2以及飽和濕度的培養箱內培養5～7 d至發育到桑葚胚或囊胚。

A.含PB1成熟卵母細胞；B. 消化卵母細胞透明帶；C. 半卵法切割去核；D. 獲得無核半卵； E.第一次電融合；F. 第二次電融合；G. 重構胚胎

2 結果與分析

利用HMC技術生產無透明帶雙半卵豬克隆胚胎的技術路線主要包括6個步驟(圖1)：消化卵母細胞透明帶、半卵法去核、第一次電融合、第二次電融合同時完成重構胚胎電激活以及重構胚胎化學激活和無透明帶HMC克隆胚胎體外培養。其中關鍵步驟包括：透明帶消化程度、手工克隆刀切割去核、WOWs的制作及大小。

2.1 ZP消化時間對切割去核的影響

根據卵母細胞透明帶消化時間分為3組，A組：少于10 s、B組：10～15 s以及C組：高于15 s。不同程度消化卵母細胞透明帶。觀察發現，消化時間少于10 s時，仍然可看到完整的ZP(圖2A)；當消化時間為10～15 s時，卵母細胞透明帶被消化，卵母細胞開始變形(圖2B)；消化時間高于15 s時，大多數卵母細胞的ZP則被完全消化(圖2C)，卵母細胞容易黏附在皿底。

將不同消化時間的卵母細胞用于切割去核，統計透明帶消化時間與消化程度對卵母細胞去核的影響。A組消化時間不足(少于10 s)會導致切割困難，卵母細胞難以被一分為二(圖3A)；B組消化時間適度(10～15 s)，卵母細胞易于被切割(圖3B)；而C組消化過度(高于15 s)則會導致卵母細胞死亡不能繼續用于去核，或在切割過程中胞質碎裂(圖3C)。從表1可知，A組ZP輕度消化時，不能用于切割的卵母細胞比率極顯著高于B組和C組(P<0.05)，B組和C組無顯著差異(P>0.05)。一旦過度消化，C組卵母細胞死亡率顯著增加，明顯高于A組和B組(P<0.05)，A組和B組差異不顯著(P>0.05)。因此，消化ZP的時間直接影響卵母細胞質量以及切割成功率。

A.輕度消化，消化時間小于10 s；B. 適度消化，消化時間10～15 s；C. 過度消化，消化時間高于10 s,箭頭指示透明帶

A.輕度消化，透明帶完整，卵母細胞難以被切割 (如箭頭所示) ；B. 適度消化，卵母細胞易于被切割；C.過度消化，卵母細胞死亡或胞質破碎(如箭頭所示)

表1 透明帶不同消化時間對切割去核效率的影響

2.3 手工克隆刀切割去核

卵母細胞完全去核是HMC能否成功的前提條件。操作人員在進行去核時，一方面要確保完全去核，另一方面需盡可能多的保留胞質來支持重構胚胎的發育。因此，熟練掌握切割刀的使用對保留足夠多胞質的同時較減小對胞質的損傷十分重要。正常情況下，包含PB1的1/2或更少的細胞質在去核過程中被去除(圖4A)。然而，因不熟練操作時或在ZP消化不當難以切割的情況下，一半或更多的細胞質容易隨細胞核一起被切除且PB1位置與切割路徑并不垂直，這不利于完全去核(圖4B)。如圖5所示，切割去核的操作細節如下：首先根據極體的位置將卵母細胞同方向排列，切割刀輕輕地放入切割滴中，將刀尖固定于距離目標卵母細胞左側2/3刀刃直線位置(圖5A)，刀刃直線與極體垂直，以鍘刀的方式壓下刀刃(圖5B)，把卵母細胞一次切開，直至所有卵母細胞去核完成。而去核完成后，因無核卵母細胞都已無透明帶保護，在液滴后續操作或等待融合時，盡可能避免多個半卵緊挨導致胞質黏連難以分開或分開時對胞質造成損傷。

2.4 WOW的制作及大小

由于HMC操作過程中卵母細胞透明帶已被消化，在體外培養過程中為防止所得無透明帶重構胚胎卵裂球脫落或多個無透明帶胚胎黏連，需采用WOWs體外培養。而WOWs的類型及大小對胚胎發育有直接影響。本試驗則采用400 μL PZM-3培養液且每孔覆蓋400 μL無菌石蠟油的Nunc四孔板，板底墊透明板，借助專用打孔釘于四孔板底部垂直手工壓制凹形微孔(圖6A)，每個微孔1個重構胚胎(圖6B)。結果證實四孔板每孔制作25～30個微孔，孔深約為250 μm，孔徑約為300 μm，更有利于胚胎發育。

A.少于1/2含極體的胞質被去除；B.多于1/2含極體的胞質被去除。箭頭指示PB1，虛線為切割路徑

A.切割時，切割刀擺放示意圖；B. 切割示意圖，切割時以鍘刀的方式向下壓刀刃。箭頭指示PB1；a指示卵母細胞；b點指示刀尖固定點；c點到固定點b的距離約為刀鋒長度的2/3；虛線d指示切割路徑垂直于極體所在位置且含極體胞質少于1/2處；e指示標準切割路徑

A.四孔板每孔內壓制25～30個微孔；B. 每1個微孔內放一個重構胚胎

3 討論

隨著體細胞核移植技術的發展，與克隆技術相關的卵母細胞體外成熟培養、去核方法、體細胞融合技術、重構胚胎激活和培養技術等均得到優化以提高SCNT的成功率[31-34]。目前，多個實驗室已成功利用HMC新技術完成體細胞核移植并成功繁育得到具有研究價值的克隆豬后代。但需要特別注意HMC是一項純手工技術，操作人員在生產重構胚胎時熟練且精確的操作是生產重構胚胎和保障克隆胚胎質量的重要基礎要求。因此，優質卵母細胞的挑選、卵母細胞透明帶消化時間的掌握、去核方法的選擇以及操作熟練度、重構胚胎的體外成熟培養等均是影響克隆效率的潛在因素，必須正確掌握和高效完成。

為了保證重構胚胎的正常發育，卵母細胞去核是最為關鍵的步驟之一。在去核過程中應盡可能去除細胞核并保留更多的胞質，從而提高體細胞重編程效率和胚胎發育能力。在SCNT技術發展中，新的去核方法不斷提出以提高去核效率，但每種去核方法針對不同物種都有其優缺點。使用TC的點壓法去核，雖除去PB1時帶走的細胞質少，對卵母細胞質損傷也相對較小，一定程度地提高了去核效率，但該方法需昂貴的顯微操作儀[35]。早期豬的HMC去核則采用活性熒光染料定位法，根據Hoechest33342對細胞核定位，以確定無核半卵。該方法雖可保證細胞核去除完全，但操作繁瑣、耗時長，且染料對細胞質有一定損傷[36]。本研究HMC去核所采用半卵法，通過極體定向手工去核(oriented handmade enucleation, OHE)[37]。成熟卵母細胞內細胞核靠近極體排出的位置，根據第一極體的位置將卵母細胞切割為兩部分，便于全部切除細胞核[38]，從而獲得無核半卵(遠離極體的半卵)。該方法不需依靠昂貴的顯微操作儀與化學試劑輔助，也不需熒光顯微鏡，整個去核過程操作簡便，僅需一把切割刀便可完成，并且利用該方法去核所生產重構胚胎后續發育能力高于化學輔助手工去核法[37]。但該方法在去核時會帶走相對較多的胞質，為彌補丟失的胞質，隨后可通過雙半卵融合技術使受體細胞質體積恢復到去核前的水平，足夠的胞質能夠提高重構胚胎發育[39]。另外，切割時，熟練掌握切割刀的使用方法對保留足夠多胞質的同時減小對胞質的損傷十分重要。需要注意切割時刀片對無透明帶保護的卵母細胞胞質具有直接的外力作用，需熟練掌握切割刀的使用方法，避免因操作不當對細胞造成不可逆的機械性損傷。

傳統克隆胚胎是帶有透明帶的，而HCM操作時消化卵母細胞透明帶是實施手工切割去核的前提條件。研究表明，去除透明帶的胚胎仍然可在體外繼續發育[40]。目前，不同物種卵母細胞透明帶消化所采用的方法不同，主要使用酸性臺式液消化小鼠卵母細胞透明帶，大多數實驗室采用鏈酶蛋白酶法消化豬卵母細胞透明帶，但所使用的處理濃度和時間有所不同[3, 41]。本研究使用3.3 mg/mL鏈蛋白酶對體外成熟培養42～44 h的豬卵母細胞消化10～15 s為最適宜處理時間，卵母細胞不會發生過度變形而無法恢復球形也不影響卵母細胞質量和切割去核。在透明帶得到適度消化的情況下，卵母細胞才更容易被切割，一旦透明帶被完全去除會造成細胞死亡或在切割過程中胞質破碎。因此，在進行透明帶消化時，需要特別注意根據鏈蛋白酶使用濃度確定適宜的消化時間。另外，因為去核前透明帶已被消化，最終所得重構胚胎為無透明帶胚胎。不同于有透明帶保護的豬胚胎體外發育常采用的培養板法(四孔板中直接加入400 μL PZM-3培養液覆蓋石蠟油進行培養)，無透明帶胚胎更多采用Vajta等[42-43]提出的微穴培養系統，一方面能夠有效防止多個無透明帶胚胎之間發生胞質黏連，另一方面一定程度防止胚胎的卵裂球脫落，該方法能夠很好的保護無透明帶胚胎并完成早期胚胎發育。

哺乳動物克隆技術缺陷以及效率不理想給體細胞核移植技術的發展帶來障礙。未來進一步優化核移植各項技術操作方法、工具和參數，以及更加深入研究供體體細胞、受體卵母細胞胞質對重構胚胎發育能力的影響機制等，相信克隆效率將得到提高，并能夠高效率高質量生產具有繁殖育種意義、生物醫學研究價值的克隆動物。

4 結論

本文詳細介紹了利用HMC生產豬重構胚胎的步驟并對操作過程中的3個關鍵環節進行了優化。首先，成熟卵母細胞透明帶在3.3 mg/mL的鏈蛋白酶中消化的最適宜時間大約為10～15 s，該消化條件既能保證透明帶已被軟化利于切割，又能防止過度消化造成卵母細胞損傷或死亡。其次，掌握“鍘刀式”切割方法沿與極體排出位置垂直的方向完成切割有利于去核完全且減小切割刀對卵母細胞的機械外力損傷。最后，使用四孔板制作孔深約為250 μm，孔徑約為300 μm的微孔更有利于重構胚胎穩定發育。