肢體內外翻畸形肉雞腿部骨骼礦物元素含量變化及組織學分析

唐賀賀,郭亞蘋,張真真,李轉見,田亞東,康相濤,韓瑞麗

(河南農業大學動物科技學院，河南 鄭州 450002)

隨著對肉雞生產性能的高強度選育，肉雞養殖生產效率得到極大提高，但雞群中骨生長發育異常和腿病問題也日益突出，給肉雞養殖業造成了嚴重的經濟損失[1]。肢體內外翻畸形(valgus-varus deformity，VVD)是肉雞常見的長骨畸形病。長骨畸形是指與正常骨相比長骨在結構或形狀上發生扭曲。VVD雞遠端脛跗骨會發生一定角度的外翻或內翻，即表現為跗關節內弧或者外撇[2-4]。發病后肉雞不能正常站立和行走，嚴重影響采食和動物福利。眾多肉雞品系中，哈伯德肉雞生長速度快，出肉率高，生產中該品種腿病發生率也相對較高。我們前期調查研究發現，哈巴德肉雞VVD腿病以單側外翻為主，患VVD腿病雞的生長性能明顯下降，血鈣含量、血磷含量都發生異常改變，堿性磷酸酶的活性受到抑制，骨骼質量降低[5-6]。

礦物元素是骨骼中重要的營養成分，在骨形成和骨吸收過程中發揮著重要作用，鈣、磷與灰分是作為評價骨骼性能的重要指標，與骨密度、骨強度等密切相關。鈣磷代謝受多種因素影響，任何造成鈣磷代謝障礙的因素均會引起不同程度的骨骼疾病[7-9]。此外，微量礦物元素對于動物的正常生長發育也至關重要。銅、錳、鋅是在動物機體內含量較低的必需微量元素。銅元素是眾多抗氧化酶的組成成分，當機體內缺銅時，抗氧化酶活性降低，影響破骨細胞的活化和增殖，降低骨骼強度[10-11]；錳缺乏能夠引起滑腱癥和脛骨短粗[12]；如果家禽缺鋅，則會導致骨骼礦化[13]。骨生長發育異常可能會對骨組織形態學造成不良影響。骨形成是骨原細胞在骨生長發育期或骨組織修復過程中增殖分化為成骨細胞，進而成熟為骨細胞存在于骨組織內[14]。在這一過程中，成骨細胞和破骨細胞起著關鍵作用，它們在多種細胞因子的調控下，協同維持骨的代謝平衡。同時，骨小梁對骨的支撐和維持血液等物質轉運也起著重要作用。故本試驗通過對肉雞脛骨中鈣、磷、灰分、銅、錳、鋅元素的含量測定和腿部骨骼切片組織學分析，探究VVD與肉雞腿部骨骼中礦物元素含量的關系及病理組織學變化情況，旨在為我國肉雞生產和VVD腿病的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為哈巴德肉雞，取自遼寧省某養殖公司。

1.2 飼養管理條件

試驗肉雞為籠養方式，7日齡時進行分籠，分籠之前的飼養密度為35只/籠，分籠之后的飼養密度為12只/籠。在1～18日齡，飼喂含1.0% 鈣、0.45% 磷、12 331 MJ/kg代謝能和21.5%粗蛋白的統一日糧；19～40日齡，飼喂含0.85% 鈣、0.38% 磷、12 958 MJ/kg代謝能和20.0%粗蛋白的統一日糧。肉雞1日齡注射新城疫疫苗、支原體疫苗和傳染性法氏囊病病毒疫苗，7日齡飲水免疫新城疫疫苗，21日齡注射新城疫疫苗。所有肉雞飼養管理方法一致，自由采食和飲水。

1.3 檢測項目與方法

1.3.1 樣品采集

試驗肉雞頸靜脈放血處死后仰臥位保定，沿腹股溝剪開皮膚和肌肉，找到股骨頭所在位置，用手術刀小心將雞腿部分離，剝離腿部肌肉等附著組織，取股骨、脛骨、跖骨樣本，-20 ℃低溫保存。

1.3.2 灰分及鈣、磷含量的測定

28、38日齡時，分別選取6只VVD腿病雞和4只健康雞，對其脛骨進行鈣、磷及灰分測定。灰分測定時，先用生理鹽水將脛骨內容物充分洗滌，之后用研缽進行充分研磨，隨后轉移到坩堝中，放入105 ℃烘箱干燥至恒重，最后經電爐碳化至無煙，放到茂福爐中550 ℃灰化，稱重，計算脛骨灰分含量。鈣、磷測定時，首先將脛骨試樣采用干法消化，之后用雙蒸水定容至100 mL，采用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)絡合滴定法測定脛骨鈣含量；采用分光光度計法測定脛骨磷含量。測定鈣、磷含量時每個樣品進行3次重復，取平均值。

1.3.3 銅、錳、鋅含量的測定

銅、錳、鋅的測定在河南海瑞正檢測技術有限公司完成，測定方法為電感耦合等離子體發射光譜法。

1.3.4 組織學檢查

甲苯胺藍染色，組織學分析。切片由武漢賽維爾生物技術有限公司制作。切片具體制作步驟如下：選取38日齡VVD腿病雞6只，健康雞4只，采集股骨、脛骨、跖骨，保存在4%的多聚甲醛中，固定液固定24 h以上；將標本浸入脫鈣液，放入微波爐10 min，溫度不超過40 ℃為宜，之后取出樣本，更換脫鈣液，置爐內繼續重復進行，操作致脫鈣完成；將脫水盒放進吊籃里于脫水機內依次梯度酒精進行脫水；將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋；將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片，厚4 μm。在20倍光學顯微鏡視野下，每張切片隨機挑選4個不同區域進行拍照，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致，然后記錄軟骨細胞數和骨細胞數；對圖片中骨小梁之外的骨組織用Adobe Photoshop CS6進行處理，然后應用Image-Pro Plus 6.0軟件以圖片標尺為標準，將上述處理過的圖片中骨小梁全部選中，進行骨小梁面積的計算。

1.4 數據統計與分析

數據采用SPSS 24.0中獨立樣本t檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 臨床檢查與腿骨采集

正常肉雞的站立姿勢是在關節處有處輕微彎曲(圖1A)，；當肢體偏離身體中線向外彎曲時，這種畸形被歸類為外翻(圖1B和1C)；相反，當右肢或左肢向內彎曲，被歸類為內翻畸形(圖1D)。通過記錄分析，最早發現這種骨骼畸形出現在7日齡(圖1B)。在28和38日齡時，分別選擇正常肉雞4只，VVD肉雞6只，處死，采集股骨、脛骨、跖骨 (圖2A)，觀察VVD肉雞腿骨的形態學變化。如圖2A所示，與正常肉雞長骨相比，VVD雞長骨形狀上發生扭曲；正常肉雞與VVD肉雞的脛骨曲度(tibal anteroposterior curvature，Tapc)有明顯差異(圖2B)。

圖1 肉雞腿部畸形分類

圖2 肉雞腿部骨骼形態學比較

2.2 不同日齡肉雞腿部骨骼鈣、磷和灰分測定

28日齡，正常組和VVD組肉雞腿骨中鈣、磷和灰分含量測定結果如表1所示：VVD雞脛骨中磷含量顯著低于正常組肉雞(P<0.05)，鈣含量和灰分含量差異不明顯，但VVD組中鈣和灰分含量與正常組相比均有下降趨勢。

通過對38日齡正常組和VVD組肉雞腿骨中鈣、磷和灰分含量測定，結果如表2所示：鈣、磷和灰分含量差異不顯著(P>0.05)，但VVD組肉雞均低于正常組肉雞。

表1 28日齡正常組和VVD腿病組肉雞腿骨中鈣、磷及灰分測定結果

表2 38日齡正常組和VVD腿病組肉雞腿骨中鈣、磷及灰分測定結果

2.3 肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量測定

如圖3所示，38日齡VVD雞和健康雞脛骨中銅、錳、鋅含量差異均不顯著，但VVD雞脛骨中銅、錳、鋅含量均略低于正常組肉雞。

圖3 銅、錳、鋅含量測定

2.4 骨組織分析及骨小梁面積、軟骨細胞和骨細胞計數

如圖4所示，健康雞骨小梁排列緊密，相互連接，無斷裂現象；VVD腿病雞骨小梁變得稀少，并伴有萎縮斷裂現象，骨小梁中白色非礦化區增多，骨細胞數明顯減少。如表3所示，VVD組肉雞股骨、脛骨、跖骨骨小梁面積和骨細胞數均顯著或極顯著低于正常組肉雞(P<0.05或P<0.01)；軟骨細胞數差異不顯著，但VVD腿病組肉雞軟骨細胞數多于正常組肉雞。

BT.骨小梁；Ch.軟骨細胞；Os.骨細胞；UR.未礦化區

表3 38日齡正常組和VVD組肉雞骨小梁面積、軟骨細胞和骨細胞計數

3 討論

3.1 VVD肉雞骨骼鈣、磷及灰分含量的變化

礦物質在家禽骨骼生長發育過程中起著重要作用。有研究表明，鈣、磷缺乏能夠導致脛骨生長板肥大區長度增長，骨骺端生長板增生帶增寬，影響骨骼的生長性能，使骨強度降低，引起骨骼變形或者挫傷，容易發生骨折[15-16]。前期研究發現，VVD肉雞血鈣、血磷等血液生化指標發生紊亂，骨骼性能降低[4]。故本試驗對不同階段肉雞腿部骨骼進行鈣、磷和灰分含量的測定，以探究骨骼中礦物元素含量的變化情況。結果顯示，28日齡VVD肉雞脛骨磷含量顯著低于健康雞，當機體內礦物質磷代謝發生紊亂時，則會引起不同程度的骨骼疾病[8]，但38日齡VVD肉雞脛骨磷含量差異不顯著，由此推測，VVD腿病可能與脛骨磷含量無關；28、38日齡的鈣含量和灰分含量未達到顯著差異水平，但與健康雞相比，均發生降低趨勢。說明28、38日齡VVD肉雞股骨、脛骨、跖骨中礦物元素含量雖然除了28日齡磷含量外，其他均無顯著差異，但腿病雞腿部骨骼中礦物元素含量均發生下降趨勢，VVD腿病的發生會對其腿部骨骼中礦物元素含量造成一定影響。

3.2 VVD肉雞骨骼銅、錳、鋅含量的變化

微量礦物元素是指機體內必需且含量小于0.01%的物質，其中銅作為多種酶的輔基，能夠影響破骨細胞的活化與增值，促進骨吸收，使骨含量減少[17]；錳缺乏能夠引起滑腱癥和脛骨短粗，對肉雞骨骼發育造成影響等[12,18]；有研究發現，鋅在骨代謝中發揮著重要作用，可以促進膠原蛋白合成和增加細胞活性，減少由破骨細胞介導的骨吸收[19]。此外，鋅可以促進成骨細胞分化，有利于骨的形成[20]。張楠[21]研究發現，在日糧中添加銅、錳、鋅等微量元素會對蛋雞產蛋性能、血漿指標、激素水平等造成影響。由于骨的正常生長發育與骨形成和骨吸收密切相關，而微量礦物元素能夠參與骨代謝過程，故本試驗首次通過直接對肉雞脛骨中微量元素的測定，探究VVD腿病與微量元素之間的關系。結果顯示健康雞和VVD肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量之間差異不顯著，但與健康雞相比，VVD肉雞脛骨中銅、錳、鋅含量均降低。這說明VVD肉雞腿骨微量元素含量存在降低趨勢，但未達到顯著差異水平，猜測可能是肉雞飼養周期較短所致。VVD腿病的發生與微量元素的關系還有待于進一步探究。

3.3 VVD肉雞骨骼病理組織學變化

各類腿病的發生常常會引起骨骼組織學的異常變化，骨小梁是長骨端內的網狀結構，構成部分包括骨小梁及表面附著的礦物質，其特定的排列方式對骨的支撐起著重要作用[22]。有研究表明，當骨小梁結構損壞時，會降低骨結構性能，易造成骨骼疾病的發生[23]。前期研究結果顯示：當肉雞患VVD后，腿部骨骼骨小梁損傷嚴重，骨小梁中央存在大量白色的未礦化的區域[5]。本研究骨組織切片分析發現，VVD腿病雞骨小梁面積顯著降低，骨小梁排列稀疏，說明骨量丟失及微結構破壞嚴重。

軟骨細胞在骨骼生長發育這一過程發揮著重要作用，軟骨組織的異常改變是腿部疾病發生的重要誘因。田文霞等研究發現，當肉雞患TD后，發病部位軟骨細胞積聚，影響正常細胞分化，最終擾亂軟骨成骨這一過程[24]。本研究未發現軟骨細胞數存在明顯差異，這可能與該腿病的發病程度及發病時間有關，另外VVD腿病的發生對骨組織中軟骨細胞數影響較小也是有可能的，但發病后，骨組織中軟骨細胞數存在增加趨勢。

骨細胞是成熟骨組織中的主要細胞，維持成熟骨的新陳代謝。呂文亭等[25]對籠養蛋雞綜合征(CLO)的研究發現，患CLO蛋雞骨小梁中骨細胞數量減少。本研究結果顯示，VVD腿病雞骨小梁中骨細胞數顯著或極顯著低于健康雞，由此推斷VVD會對骨小梁中骨細胞數造成嚴重影響。因為骨細胞位于骨小梁中，這也與上述結果VVD病雞骨小梁面積顯著降低相符合。

4 結論

研究表明，VVD肉雞骨磷含量顯著降低，股骨、脛骨、跖骨中各礦物元素含量均有下降趨勢；此外，該腿病會導致腿部骨骼組織學結構的異常變化，骨小梁面積和骨細胞數顯著降低，骨骼礦化障礙，骨量丟失，影響其正常的生理特性。