3種新疆產藥材的降血糖作用研究

游鳳，孟晉武，肖迪，王金麗，王穎，劉家國

(南京農業大學動物醫學院/教育部“動物健康與食品安全”國際合作聯合實驗室，江蘇 南京 210095)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種常見的慢性代謝性疾病，當機體產生胰島素不足或者發生對胰島素的反應缺失時，會造成碳水化合物的代謝異常，進而導致血液和尿液中的葡萄糖水平升高，并引起一系列的并發癥。近年來，隨著人們生活的逐步城市化，以及寵物飼養管理不當，糖尿病在人和寵物中的患病率均呈逐年快速上升的趨勢。有調查表明，糖尿病犬貓的平均中位存活期僅為964 d(32個月)[1]。

目前廣泛使用的降糖西藥及胰島素均有不同程度的副作用[2-3]。因此，需要開發降糖效果優良且副作用小的降糖藥物，中藥具有很大的潛力。香茅草、芡實、睡蓮花3種新疆產藥材資源豐富，分布廣泛，且具有歸經明確、以及良好的全身性調整作用[4-6]，對內分泌紊亂的糾正有獨特效果，且副作用小。以往主要在清熱解毒、抗菌抗病毒、增強免疫等方面應用與研究，關于其降糖作用的報道較少。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是輔助哺乳動物體內碳水化合物轉化為葡萄糖的關鍵酶，在餐后血糖的升高中起著關鍵作用[7]。因此，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制劑可通過各種機制減緩腸道內葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。正常小鼠快速高血糖模型是一種使血糖快速升高的簡單靈敏且可操作性強的體內模型，相比于體外降糖試驗，該試驗使得藥物在體內會經歷真正的代謝，所得數據更加具有說服力，與真正的糖尿病大鼠模型相比，更加節省時間，且難度降低，是良好的篩選降糖藥物的研究模型[8]。本試驗主要通過研究3種新疆產藥材提取物對2種酶的抑制率，來探究3種藥物提取物的體外降糖作用，并且通過研究對快速高血糖小鼠模型的影響來探究其在體內的降糖作用。

1 材料與方法

1.1 動物

ICR小鼠，雄性，體重(18～20 g)共25只，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物合格證號：201920941，動物許可證號：SYXK(蘇)2017-0001。

1.2 受試藥物及準備

香茅草、睡蓮花由新疆農業大學提供，芡實購自江蘇天晟醫學科技有限公司，產地為新疆。

香茅草：室溫下，稱取香茅草20 g，按料液比1∶20加入400 mL蒸餾水，煮沸，維持沸騰40 min，重復2次，置完全冷卻，3層濾紙過濾，取煎液，然后加入到真空旋轉蒸發儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

睡蓮花：室溫下，稱取睡蓮干花20 g，按料液比1∶20加入400 mL(淹沒過藥末表面)70%的乙醇超聲波萃取，超聲溫度56 ℃，超聲時間40 min，重復兩次。3層濾紙抽濾。然后加入到真空旋轉蒸發儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

芡實：室溫下，取一定量的芡實，進行粉碎之后取芡實粉末20 g，按料液比1∶15加入300 mL 70%的乙醇，放置在90 ℃水浴鍋中水浴4 h，3層濾紙抽濾，然后加入到真空旋轉蒸發儀中濃縮至每毫升2 g生藥。

1.3 試劑

3, 5二硝基水楊酸/DNS(20180427)購自廣東光華科技有限公司；可溶性淀粉(1711092)購自西隴科學股份有限公司；酒石酸鉀鈉(20180712)購自廣東光華科技股份有限公司；α-淀粉酶(L28O8D46151)購自上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(R06D8Y50059)購自上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯基-α-D吡喃葡萄糖苷/pNPG(K22J9B64113)購自上海源葉生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍腸溶片(181103)，購自北京京豐制藥有限公司，用去離子水每天現配現用；50%葡萄糖溶液(E18120305)，購自湖南科倫制藥有限公司。

1.4 方法

1.4.1 3種新疆產藥材的體外降糖作用比較

參照葉瓊仙等[9]和蘇堯堯[10]的方法，并稍作改進。

對ɑ-淀粉酶活性的抑制能力的檢測：將500 μL的待測樣品與500 μL 1 U/mL的α-淀粉酶溶液加入試管中，在37 ℃水浴中反應30 min，加入1%的淀粉溶液1 mL，繼續37 ℃水浴反應15 min，水浴反應結束后，立即加入1 mL DNS顯色劑，并且沸水浴5 min后冷卻至室溫。按照1∶20的比例加入蒸餾水進行稀釋混勻，于540 nm處進行吸光度的測定。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示α-淀粉酶溶液+樣品+淀粉溶液+DNS顯色劑；A背景表示樣品+淀粉溶液+DNS顯色劑；A空白表示α-淀粉酶溶液+淀粉溶液+DNS顯色劑。

對ɑ-葡萄糖苷酶活性的抑制能力的檢測：在96孔板中加pH值5.0的磷酸鹽緩沖溶液40 μL，加入樣品溶液40 μL，再加入7 000 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混勻，在37 ℃下反應30 min，而后加入2.5 mmol/L的pNPG溶液40 μL，繼續在37 ℃反應30 min，最后加入100 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。于405 nm波長(測的是PNP)處測定吸光值。

抑制率=(1-(A抑制-A背景)÷A空白)×100%(A指吸光度)，其中：A抑制表示緩沖溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+樣品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A背景表示緩沖溶液+樣品溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液；A空白表示緩沖溶液+α-葡萄糖苷酶溶液+pNPG溶液+Na2CO3溶液。

1.4.2 標準曲線的建立

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性抑制試驗均以阿卡波糖(α-葡萄糖苷酶抑制劑)作為陽性對照(阿卡波糖+酶液+底物)，制作標準曲線。

1.4.3 3種新疆產藥材對腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影響比較

所有小鼠適應性飼養7 d后，隨機分為5組：芡實提取物組(EUR)、香茅草提取組(CYM)、睡蓮花提取組(NYM)、二甲雙胍(陽性對照)組(MET)和模型組(Model)。芡實各組每早9:00準時以相應受試物懸液10 g/kg灌胃，陽性藥對照組給予二甲雙胍75 mg/kg，模型組灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為0.2 mL/20 g，連續灌胃2周。最后一次給藥后，各組小鼠禁食(不禁水)6 h，先測量空腹血糖，再分別灌胃給受試藥物，給藥30 min后，各組小鼠腹腔一次性注射50%葡萄糖溶液0.1 mL/20 g，尾尖采血，用血糖儀測定葡萄糖注射后15、30、45、60、90和120 min時間點的血糖值。血糖值結果用mmol/L表示。采用GraphPad Prism 5.01軟件計算曲線下面積(area under the cure，AUC)，比較各組的葡萄糖耐量水平。

1.5 數據統計分析

統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行，各組數據以“平均數±標準差”表示，兩組間差異的顯著性采用t檢驗進行統計學分析，P<0.05表示具有統計學差異。

2 結果

2.1 阿卡波糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制標準曲線

如圖1、圖2可知，阿卡波糖標準曲線呈現隨著阿卡波糖濃度的增大，抑制率增加逐漸變緩，即曲線斜率變小的情況，直接用直線對其擬合所得的標準曲線公式R2較大，采用自然對數公式y=aLn(x)+b進行擬合，基本符合曲線走向。

圖1 阿卡波糖對α-淀粉酶抑制曲線

圖2 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制曲線

2.2 各受試藥物對α-淀粉酶的抑制作用

香茅草提取物和芡實提取物對α-淀粉酶的抑制能力與藥物濃度呈正相關，在2 g生藥/mL時，二者對淀粉酶的抑制能力最佳，對α-淀粉酶的抑制率分別達88.3%和79.8%，睡蓮花提取物在試驗中并未表現出對α-淀粉酶有抑制作用。見表1。

表1 各受試藥物對α-淀粉酶的抑制作用

2.3 各受試藥物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由表2可知，香茅草提取物和睡蓮花提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制能力與藥物濃度呈正相關，睡蓮花提取物的抑制能力更佳，在1 g生藥/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率就達76.0%，而芡實提取物在試驗中并未表現出對α-淀粉酶有抑制作用，香茅草提取物的抑制能力也較差。

2.4 3種新疆產藥材對腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的影響

由表3可知，各組的基礎血糖值睡蓮花提取物組最低，芡實提取物組最高，在腹腔注射葡萄糖15 min后，各組的血糖值均有顯著提升，并達到峰值，其中芡實提取物組的峰值最高，睡蓮花提取物組、香茅草提取物組和二甲雙胍組的峰值均低于模型組，其中睡蓮花組最低，較模型組低10.29%。自30 min開始，各組血糖值開始不同程度的下降，睡蓮花提取物組的下降速度僅次于二甲雙胍組，在各個時間點的血糖值均低于模型組；比較血糖曲線下面積AUC可以發現，睡蓮花提取物組AUC與二甲雙胍組相近，均低于模型組，與香茅草提取和睡蓮花提取物均有顯著差異。而芡實提取物和香茅草提取物組的血糖調節能力較差。

表2 各受試藥物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

表3 3種新疆產藥材對腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型的血糖值影響 mmol/L

3 討論

作為一種需要終身治療的慢性內分泌疾病，糖尿病給患寵本身和寵物主人均帶來了很大的困擾。防治糖尿病，開發效果優良、副作用更小的降糖藥已成為研究熱點。

由于傳統降糖藥物，如二甲雙胍類、格列本脲類雖然具有良好的降糖效果，但是其療效仍然十分有限，不僅無法阻止胰腺進一步壞死，也無法刺激機體產生足夠的胰島素，而且會引起消化系統、泌尿系統等多系統損傷，尤其是肝腎損傷，其嚴重的胃腸道副作用也使患病動物的生活質量得不到保障。因此，近年來，尋找降糖效果好，且對機體副作用小的新型天然植物降血糖藥物逐漸成為研究熱點。

香茅草性味溫、辛，功效眾多，具有祛風通絡、和胃通氣、溫中止痛、止瀉、醒腦催情的功效。以往對香茅草的研究主要集中揮發油，但香茅草的水提液和醇提液中含有黃酮、多糖等7種成分，植物多糖是近年來抗糖尿病的熱門成分，其能激活過氧化體增殖物激活型受體(PPAR)活性進而激活體內細胞葡萄糖的轉運和利用。王琦等[11]測量超聲提取的香茅草多糖含量為6.49%。此外，也有報道香茅草的根和葉有胰島素樣物質[12]。因此，香茅草可能具有一定的降糖潛力。芡實在中醫上歸于腎經和脾經，有健脾利濕益腎、祛濕止帶的作用，芡實味甘，常與其他藥食同源的中藥飲片一同食用，可起到不同的功效；有中醫工作者將芡實作為一種輔助食物添入糖尿病患者的主食中，作為早晚餐使用，降糖效果顯著[13]；也有研究發現芡實殼三萜類提取物能改善糖尿病小鼠的血糖和血脂，并改善胰島素抵抗狀況[14]。關于芡實總醇提物的降糖效果，目前也未見報道。

在本次試驗中，香茅草提取物和芡實提取物均對α-淀粉酶表現出較好的抑制能力，在2 g生藥/mL時，其抑制率分別達88.3%和79.8%，表明其具有良好的體外降糖活性，但是其對腹腔注射葡萄糖所致小鼠快速高血糖模型表現出來的降糖效果并不理想。

睡蓮花味辛辣、苦甜，其具有清熱解毒的功效，其成分多樣。近年來對睡蓮花的降血糖作用的研究有所增加，發現具有明顯的腸內葡萄糖苷酶抑制作用[15]。Rajagopal等[16]對睡蓮花醇提物對正常大鼠和四氧嘧啶誘導糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量情況進行比較，發現其對糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，但機制不明；趙軍[17]研究了睡蓮花的有效成分，在有效成分對二肽基肽酶Ⅳ抑制活性的高通量篩選試驗中發現，睡蓮花提取物確實具有一定的降血糖作用，并可能與睡蓮花多酚含量較高有關。

在本次試驗中，睡蓮花提取物僅對α-葡萄糖苷酶表現出了抑制作用，對α-淀粉酶活性未表現出抑制作用。景贊等[18]已經證實了藍睡蓮花的多酚類提取物對大鼠小腸麥芽糖酶與α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，但是對豬胰α-淀粉酶和大鼠蔗糖酶的活性沒有明顯影響，與本次試驗結果基本相符。睡蓮花提取物組的AUC僅次于二甲雙胍組，雖然與模型組之間沒有顯著差異，其基礎血糖值與注射后15 min峰值都是所有組里面最低的，在30 ～120 min期間的5個時間點里，睡蓮花提取物組的血糖值也是要低于其他組的，基礎血糖值發生變化這說明睡蓮花提取物組提前2周的藥物調理對機體產生了某些影響，而其峰值的降低以及快速的下調體內高血糖則說明其機體對血糖的吸收有所抑制，同時血糖調節能力也得到了一定的優化，雖然尚不清楚其具體降糖機制，但是結合其良好的體外降糖作用，可以推測睡蓮花提取物具有較好的降糖潛力。