基于ISSR-PCR的長白落葉松種子園單株遺傳多樣性分析

邱新宇 張含國 黎家俊 玉蘇普·賽迪艾合麥提胥麗雅 張素芳 張磊

摘要：? 以長白落葉松無性系種子園347個單株為試驗材料，利用ISSR-PCR分子標記技術分析其遺傳多樣性的結果表明，長白落葉松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。11條引物共擴增出172條譜帶，其中，多態性譜帶169條，多態位點比率為98.26%，基因多樣性指數0.285 5，Shannon多樣性指數0.479 5～0.520 4，Nei's 指數0.064 0～0.436 0。

關鍵詞：? ISSR;? 長白落葉松;? 單株;? 遺傳多樣性

中圖分類號：? ?S 791. 22， S 722. 7? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001 - 9499（2019）02 - 0023 - 03

長白落葉松（Larix olgensis）為松科落葉松屬，主要分布于東北林區，其速生性、耐腐性和力學特性優于其他松科植物，常作為木材工業原料使用，是我國主要的造林樹種之一。不同物種的遺傳物質是不同的，在特定的環境條件中，通過群體的遺傳多樣性研究可以了解物種遺傳物質的豐富程度[ 1 - 2 ]。物種的遺傳多樣性越豐富，適應環境變化的能力就越強，越不容易滅絕[ 3 ]。DNA標記是目前最有效的遺傳多樣性研究方法，其中，ISSR分子標記簡單便捷、開發成本低，被廣泛應用于遺傳多樣性研究中。本研究以黑龍江省林口青山林場的長白落葉松種子園為研究對象，在DNA水平上研究長白落葉松無性系種子園的遺傳多樣性，以此了解長白落葉松對環境的適應能力，為種質資源親緣關系的鑒別、評價和利用提供參考依據。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料源于牡丹江林口縣青山林場，采自1994年定植的長白落葉松無性系種子園第78區的347個單株。2016年6 月下旬，采取當年生幼嫩針葉，分袋裝好并標記，置于冰箱-80℃冷凍保存，用于提取樣本總DNA。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取

使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司生產）提取長白落葉松樣品總DNA。

1. 2. 2 DNA質量檢測

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外吸收法檢測DNA 質量。根據DNA凝膠條帶判斷DNA的完整性，若窄帶集中，說明DNA完整性較好。利用分光光度計測定DNA濃度與純度，為保證后續試驗順利進行，濃度需大于200 ng/ul，OD260/OD280=1.8～2.0。將已提取的DNA模板置于-40℃冰箱保存待用。

1. 2. 3 引物篩選

以100條試驗室已有引物（來源：林木遺傳育種國家重點試驗室的ISSR引物，部分加拿大哥倫比亞大學公布的第9套ISSR引物序列）為篩選目標，隨機選取4個單株作為引物篩選樣品。

1. 2. 4 ISSR-PCR反應體系和擴增程序

根據PCR電泳結果選擇譜帶清晰的引物，按照落葉松ISSR-PCR反應體系和擴增程序[ 8 - 10 ]，隨機選用不同樣品進行PCR擴增。在1×TAE緩沖液中，將擴增產物用含有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，在紫外燈下拍攝保存記錄結果。

1. 2. 5 分子標記數據統計與分析

參照電泳圖譜中分子量標準，分析PCR 擴增產物片段的大小，推算擴增產物的分子量。有DNA條帶的記為“1”，無DNA條帶的記為“0”。利用 Popgene32軟件計算得到供試材料的等位基因數、有效等位基因數、Nei's基因多樣性指數、Shannon 多樣性指數等相關參數[ 11 - 12 ]。

2 結果與分析

2. 1 DNA質量檢測

由DNA 瓊脂糖檢測結果（圖1）可以看出：窄帶比較集中，提取的長白落葉松DNA樣品質量較好，其濃度及純度均符合試驗要求。

2. 2 引物篩選

根據電泳結果，選擇條帶清晰、差異明顯、重復性和穩定性較好的引物進行遺傳多樣性分析，從100個引物中共篩選出了11個引物，引物編號及序列見表1。

2. 3 ISSR-PCR擴增

多態位點比率反映了群體遺傳變異水平的高低，對環境適應能力強的群體多態位點比率也比較高。利用11個引物對長白落葉松無性系347個單株的DNA 樣品進行ISSR-PCR 擴增，共檢測到 172個位點，位點范圍為100 bp～3 000 bp。每個引物平均擴增 15.63個條帶，多態位點有169個，多態位點比率高達 98.26%。其中，引物900擴增位點最多，有20個位點，多態位點百分率為55%;引物854多態位點最少，有11個位點，多態位點百分率為63.64%。

2. 4 單株遺傳多樣性分析

由單株遺傳多樣性分析結果（表4）可以看出：（1）單株等位基因平均數范圍為1.000 0～2.000 0，有效等位基因數變動范圍為1.000 0～1.999 9。14、44、45號3個單株有效等位基因數最低，其值均為1.000 0，第143株有效等位基因數最高，其值為1.999 9。（2）基因多樣性指數最大為0.500 0，最小為0.000 0;Shannon指數最大為0.692 6，最小為0.000 0，單株間遺傳變異變化幅度為0.479 5～0.520 4，不同單株遺傳變異變化幅度為0.064 0～0.436 0，種群總體遺傳變異平均值為0.285 5，試驗樣本種內單株之間的遺傳變異明顯，群體分化強烈。（3）遺傳距離范圍為0.017 6～0.658 9，347個長白落葉松單株的親緣變化幅度較大。

3 結論與討論

本次對長白落葉松種子園單株樣本進行ISSR標記，共檢測到 172個位點，多態位點比率為98.26%，表明長白落葉松不同單株間相似度低、多態性高，單株之間的遺傳變異明顯，群體分化強烈，個體間的親緣關系變幅較大。據此可以判斷，長白落葉松種子園單株遺傳多樣性較高，可提供大量無親緣關系的優良種子。

參考文獻

[1] Soltis PS， Slotis DE.Genetics variation in endemidc and widespread plant species： Examples from Szxifragaceae and Polystichum. Aliso， 1991， 13： 215 - 223.

[2] 林萍，? 張含國，? 謝運海.? 正交設計優化落葉松ISSR-PCR反應體系.? 生物技術，? 2005，? 15（5）：? 34 - 37.

[3] 馬麗，? 侯樂峰，? 郝兆祥，? 等.? 82個石榴品種遺傳多樣性的ISSR分析[J].? 果樹學報，? 2015，? 32（5）：? 741 - 750.

[4] Akhare A， Sakhare S， Kulwal P， et al.RAPD profile studies in Sorghum for identification of hybrids and their parents[J].Int J Inter Biol， 2008， 3（1） ： 18 - 24.

[5] 錢韋，? 葛頌，? 洪德元.? 采用RAPD和ISSR標記探討中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[J].? 植物學報，? 2000，? 42：? 741.

[6] Ge X J， Sun M. Reprodutive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous mangrove Aegiceras corniculatum （Myrtinaceae） using allozyme and intersimple sequence repeat （ISSR） analysis[J]. Mol E col， 1999， 8： 2 061.

[7] 胡連清，? 王清明，? 丁顯平，? 等.? 極危物種——南川木波羅遺傳多樣性ISSR分析[J].? 四川大學學報（自然科學版），? 2018，? 55（04）：? 865 - 872.

[8] Camacho F J， Liston A. Population structure and genetic diversity of Botrychium pumicola（Ophioglossaceae） based on inter-simple sequence repeats （ISSR）[J]. Am J Bot， 2001， 88： 1 065.

[9] 郭艷，? 洪建聰，? 陳鈮鈹，? 等.? 白及遺傳多樣性的ISSR分析[J].? 中成藥，? 2018，? 40（09）：? 2 020 - 2 024.

[10] 姚宇，? 張含國，? 張振，? 等.? 去劣疏伐對長白落葉松初級無性系種子園SSR遺傳多樣性的影響[J].? 中南林業科技大學學報，? 2013，? 33（03）：? 40 - 46.

[11] 于大德.? 華北落葉松種子園遺傳多樣性及親本分析[D].? 北京林業大學，? 2014.

[12] 范英明.? 華北落葉松天然群體SSR標記遺傳多樣性分析[D].? 北京林業大學，? 2014.

第1作者簡介：? 邱新宇（1996-），? 女，? 本科，? 研究方向：? 林木遺傳育種。

通訊作者：? 張含國（1962-），? 男，? 教授，? 博導，? 研究方向：? 林木遺傳育種。

收稿日期： 2019 - 01 - 06

（責任編輯：? ?王 巖 ）