推拿按法對腰椎間盤突出癥大鼠步態(tài)及背根神經(jīng)節(jié) 白細(xì)胞介素-23及其受體蛋白表達(dá)的影響

林堅(jiān)，江煜，陳水金，陳樂春，陳進(jìn)城，張幻真，林志剛

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003； 2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003

腰椎間盤突出癥是由于腰椎間盤退變、纖維環(huán)破裂，髓核突出，刺激或壓迫神經(jīng)根、馬尾神經(jīng)而引起腰腿部疼痛的一種疾患，也是臨床上發(fā)生腰腿疼痛的主要病因，常伴隨劇烈、持久的疼痛。推拿廣泛應(yīng)用于腰椎間盤突出癥的治療，具有很好的臨床療效[1]。研究表明，背根神經(jīng)節(jié)的白細(xì)胞介素-23（IL-23）及其受體（IL-23R）能誘導(dǎo)初級中樞的外周敏化，從而參與腰椎間盤突出癥疼痛的發(fā)展和維持過程[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，推拿對腰椎間盤突出癥大鼠有很好的鎮(zhèn)痛作用[3]，但其作用機(jī)制是否與背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R相關(guān)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬觀察推拿按法對腰椎間盤突出癥模型大鼠右后足步態(tài)參數(shù)的影響，以及對背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)的影響，探討推拿按法對腰椎間盤突出癥的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量180～220g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，室溫22 ℃，濕度45%，12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.2 主要儀器與試劑

CatWalk XT型步態(tài)分析儀（瑞士Noldus公司），自行研制大鼠推拿操作指套裝置（專利號201821318407.9），自行研制大鼠推拿操作固定器（專利號201821139321.X），AVANTI J-15R型高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），SLPe-SLPt型超聲波細(xì)胞破碎儀（美國BRANSON公司），Tetra型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），Gene Pulser Xcell型電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Gel Doc EZ型成像及分析軟件（美國Bio-Rad公司）。Rabbit anti IL-23（美國Abcam公司，貨號ab45420），Rabbit anti IL-23R（美國Abcam公司，貨號ab53656），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國Jackson Immunolab公司，貨號09602），免疫組化檢測試劑盒（美國CST公司，貨號8109）。

1.3 分組及造模

實(shí)驗(yàn)大鼠單籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、推拿組，每組8只。參照文獻(xiàn)[4]制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型。模型組和推拿組大鼠麻醉后，固定，備皮，于大鼠右股骨中段后方約1 cm處平行于股骨暴露坐骨神經(jīng)主干，用4-0鉻制羊腸線分3道結(jié)扎坐骨神經(jīng)，每道間隔約1 mm，縫合。模型制備后大鼠出現(xiàn)跛行，足呈輕度外翻狀，且有時(shí)出現(xiàn)舔舐、懸空等后肢保護(hù)現(xiàn)象為造模成功。

1.4 干預(yù)

推拿組在CCI造模后第4日開始對右側(cè)腓腸肌“承山”進(jìn)行按法干預(yù)，每日1次，每次10 min，直至造模后第17日結(jié)束（共干預(yù)14次）。手法干預(yù)前需將大鼠置于自行研制的推拿操作固定器5 min，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境。為規(guī)范手法刺激量，操作過程中右手拇指套上自行研制的大鼠推拿操作指套裝置，以拇指端置于大鼠右側(cè)腓腸肌“承山”上，以腕關(guān)節(jié)為支點(diǎn)，掌指部主動施力，做與腓腸肌相垂直的按壓。設(shè)定手法數(shù)據(jù)參數(shù)為壓力40 N、頻率60次/min。見圖1。正常組及模型組僅予相同抓取與固定。

圖1 推拿按法操作和力學(xué)參數(shù)圖

1.5 步態(tài)檢測

造模前對大鼠進(jìn)行連續(xù)數(shù)日的適應(yīng)性訓(xùn)練，直至無外界刺激情況下所有大鼠能連續(xù)3次不停頓且勻速地通過通道[5]。利用CatWalk步態(tài)分析儀高速攝像儀捕捉造模前及造模后第1、3、7、10、14、17日大鼠右后足步態(tài)參數(shù)，通過步態(tài)分析儀的Auto-analysis技術(shù)，對步態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取。本實(shí)驗(yàn)從最大接觸面積、足印面積及擺動時(shí)間來評價(jià)大鼠的肢體功能情況。

1.6 背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)觀察

步態(tài)檢測結(jié)束后處死所有大鼠，切取大鼠右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，切片，固定，HE染色，光鏡下觀察大鼠右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)。

1.7 免疫熒光染色檢測背根神經(jīng)節(jié)白細(xì)胞介素-23及其受體蛋白表達(dá)

取大鼠右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，經(jīng)染片、沖洗、甲醇破膜、沖洗、驢血清封閉、一抗孵育、沖洗、二抗避光孵育、封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 Western blot檢測背根神經(jīng)白細(xì)胞介素-23及其受體蛋白表達(dá)

取大鼠右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)，稱重，于冰上加入裂解液（組織∶裂解液為1∶12.5 mg/mL），裂解30 min，超聲勻漿，高速離心10 min，取上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后冰冷轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入IL-23、IL-23R一抗孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)成像，Image Lab軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊用LSD法，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 推拿按法對模型大鼠右后足步態(tài)參數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠右后足最大接觸面積、足印面積顯著減少，擺動時(shí)間明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，推拿組大鼠右后足最大接觸面積、足印面積增加，擺動時(shí)間減少，第17日差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1～表3。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足最大接觸面積比較（±s，mm2）

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足最大接觸面積比較（±s，mm2）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常組 8 68.2±6.0 64.0±9.2 68.6±10.3 66.7±11.4 74.6±11.8 70.6± 7.6 68.0± 9.4 模型組 8 67.2±6.0 18.0±6.9** 19.2± 6.2** 25.2± 6.2** 28.9±10.4** 32.7± 4.0** 36.0± 1.8** 推拿組 8 61.0±7.5 12.0±9.3 18.3± 7.6 31.0± 8.0 32.6± 7.3 44.7±11.9# 48.6±10.7#

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足足印面積比較（±s，mm2）

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足足印面積比較（±s，mm2）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常組 8 91.9±7.1 88.5±12.3 94.4±10.3 94.9±13.5 103.3±16.1 94.9± 5.8 88.2± 9.9 模型組 8 91.4±7.8 27.3± 6.7** 24.5±12.2** 42.4± 7.5** 43.8± 7.5** 56.1±11.6** 58.6± 4.5** 推拿組 8 89.7±9.3 24.4±21.5 19.1±11.6 42.6±10.1 51.1± 5.2 57.1±14.8 71.1±14.8#

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足擺動時(shí)間比較（±s，s）

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)右后足擺動時(shí)間比較（±s，s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 造模前 第1日 第3日 第7日 第10日 第14日 第17日 正常組 8 0.11±0.015 0.11±0.011 0.11±0.014 0.11±0.009 0.12±0.015 0.11±0.016 0.12±0.015 模型組 8 0.12±0.014 0.36±0.071** 0.30±0.050** 0.20±0.035** 0.20±0.029** 0.21±0.013** 0.19±0.022**推拿組 8 0.12±0.009 0.40±0.133 0.27±0.058 0.20±0.057 0.16±0.047# 0.16±0.030# 0.13±0.040#

2.2 推拿按法對模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)的影響

正常組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰，細(xì)胞核完整清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)變形、溶解現(xiàn)象，邊界不清，細(xì)胞質(zhì)呈深紫色，細(xì)胞核偏移，可見炎性細(xì)胞浸潤；推拿組大鼠背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)無明顯改善。見圖2。

2.3 推拿按法對模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)白細(xì)胞介素-23及其受體蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，推拿組大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白陽性表達(dá) （免疫熒光染色，×200）

圖4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)比較（±s，每組8只）

3 討論

腰椎間盤突出癥屬中醫(yī)學(xué)“經(jīng)筋病”范疇。《素問?痿論篇》有“陽明者，五臟六腑之海，主潤宗筋，宗筋主束骨而利機(jī)關(guān)也”，表明經(jīng)筋有約束骨骼、協(xié)助運(yùn)動的功能。經(jīng)筋功能失常則表現(xiàn)為肢體疼痛、活動不利等癥狀，如《素問?長刺節(jié)論篇》記載“病在筋，筋攣節(jié)痛，不可以行，名為筋痹”，與腰椎間盤突出癥臨床表現(xiàn)吻合。研究顯示，腰椎間盤突出癥非手術(shù)治療方法眾多，涉及牽引、理療、手法、藥物和針灸等，均有一定的臨床療效[6]。推拿已應(yīng)用于腰椎間盤突出癥的治療，是目前臨床治療腰椎間盤突出癥的主要方法之一[7]。

本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠作為研究對象，因其身體較小，故選擇按法為干預(yù)手法。本實(shí)驗(yàn)選擇“承山”進(jìn)行干預(yù)，承山是臨床治療腰椎間盤突出癥的要穴，且此處肌肉較為豐滿，便于進(jìn)行推拿手法的操作。

由于動物無法言表疼痛情況，因此評估疼痛程度常通過考察動物行為學(xué)的變化。CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)利用腳印光亮折射技術(shù)，通過高速攝像機(jī)捕獲動物的足跡，能客觀地檢測動物步態(tài)行為[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道，足印面積、最大接觸面積及擺動時(shí)間等步態(tài)指標(biāo)與疼痛相關(guān)[9]。因此，本研究通過CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)采集分析上述步態(tài)指標(biāo)，評估推拿手法對腰椎間盤突出癥模型大鼠步態(tài)的影響，更客觀、更精確地評價(jià)推拿手法對腰椎間盤突出癥的療效。本研究結(jié)果顯示，推拿按法能改善腰椎間盤突出癥模型大鼠步態(tài)行為，表明推拿手法對腰椎間盤突出癥模型大鼠的運(yùn)動功能起到積極作用。

目前認(rèn)為，外周敏化和中樞敏化是腰椎間盤突出癥疼痛的主要機(jī)制，外周敏化是指周圍神經(jīng)系統(tǒng)對傷害刺激敏感性增強(qiáng)。研究證實(shí)，抑制初級感覺神經(jīng)元的外周敏化能減輕疼痛[10]。IL-23是背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)重要的炎癥因子。Jana等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IL-23能通過p-38MAPK信號通路介導(dǎo)疼痛。同時(shí)，IL-23能誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生IL-17、IL-6、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及一氧化氮合酶等炎癥因子，從而強(qiáng)化疼痛信號通路[12]。研究表明，IL-23/IL-23R是一條重要的信號軸，能強(qiáng)化NMDANR1的磷酸化，引起背根神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生外周敏化，在許多疾病中起重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示，CCI造模后大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23及IL-23R蛋白表達(dá)均顯著升高，參與疼痛的產(chǎn)生和維持，該結(jié)果與上述研究類似。經(jīng)推拿按法干預(yù)后，背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)明顯降低，表明推拿按法對腰椎間盤突出癥模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)有抑制作用。

綜上，推拿按法能改善腰椎間盤突出癥模型大鼠右后足最大接觸面積、足印面積及擺動時(shí)間等步態(tài)指標(biāo)，抑制背根神經(jīng)節(jié)IL-23、IL-23R蛋白表達(dá)，通過調(diào)控周圍神經(jīng)系統(tǒng)的外周敏化達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，這可能是推拿按法治療腰椎間盤突出癥的分子機(jī)制之一。