miR-145-5p靶向調控MRGBP基因表達對晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響

胡超前

白內障是一種晶狀體混濁的疾病，可導致嚴重的視力損害或致盲[1]。白內障約占所有致盲原因的42%[2]，是全球致盲的主要原因[3]。其中，年齡相關性白內障是成年人最常見的白內障類型，與視覺和認知障礙以及抑郁癥有關[4]。晶狀體上皮細胞可分化為晶狀體纖維，在晶狀體的生物學功能中起著重要的作用。根據報道，除了先天性白內障外，晶狀體上皮細胞的凋亡是所有類型白內障的細胞基礎[5]，但晶狀體上皮細胞凋亡的機制尚未完全闡明。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類廣泛存在于動植物體內的小分子RNA，參與轉錄后基因調控。它們還參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程[6]。新的證據表明，miR-145-5p在各種疾病的細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和炎癥中發揮著關鍵作用[7-9]。并且miR-145-5p的抑制可以提高高糖誘導的視網膜神經節細胞的增殖，和抑制細胞凋亡，miR-145-5p可能成為糖尿病視網膜病變的潛在靶點[10]。MRG結構域結合蛋白(MRG domain binding protein，MRGBP)在胰腺癌中高表達，其低表達可以促進細胞的凋亡，并抑制胰腺癌細胞的生長[11]。然而miR-145-5p在白內障中的作用及其是否通過靶向MRGBP調控晶狀體上皮細胞增殖和凋亡目前尚未可知。因此，本研究構建晶狀體上皮細胞凋亡模型，研究miR-145-5p在其中的表達及對細胞增殖、凋亡的影響，并結合MRGBP對其作用機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SRA01/04細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，DMEM培養基購自美國Gibco公司，實時熒光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)相關檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司，MRGBP抗體購自美國Santa Cruz公司，細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3/C-caspase-3)購自美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋公司，anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其陰性對照、熒光素酶報告載體購自廣州銳博生物有限公司，異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(Propidium iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 細胞培養與處理 SRA01/04細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37℃、5% CO2、飽和濕潤的培養箱中孵育。觀察到細胞生長至80%～90%融合時，加入胰酶消化，并接種傳代。建立晶狀體上皮細胞凋亡模型時，參照秦宇等[12]用紫外線照射的方法進行操作，即收集對數生長期的SRA01/04細胞，置于360 μW/cm2照射強度的紫外燈下照射25 min。照射完成后，細胞于37℃、5% CO2的條件下繼續培養4 h，同時將正常培養的細胞設為對照。

1.3 qPCR檢測miR-145-5p、MRGBP mRNA水平 在SRA01/04細胞中加入TRIzol試劑提取總RNA，通過逆轉錄試劑盒制成cDNA，以cDNA為模板，利用qPCR檢測試劑盒測定miR-145-5p、MRGBP mRNA表達。引物序列分別為miR-145-5p：5’-GTCCAGTTTTCCCAGG

AATC-3’(正向)，5’-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3’(反向)，MRGBP：5’-GGAGGAGACAGTGGTGTGG-3’(正向)，5’-CATGTGGAAGTGTCGGTTCA-3’(反向)，內參U6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。反應結束后，由2-ΔΔCt法計算miR-145-5p、MRGBP mRNA表達。

1.4 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測MRGBP蛋白表達 使用RIPA裂解液提取SRA01/04細胞中的蛋白，BCA法定量后進行10%的十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)電泳，轉膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，將膜與1∶1 000稀釋的MRGBP一抗4℃孵育過夜，次日使用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)充分漂洗膜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗膜，加入增強化學發光液顯色，以β肌動蛋白(β-actin)為參照，分析MRGBP蛋白條帶。

1.5 細胞轉染 將5×105個/ml密度的SRA01/04細胞接種于6孔板，細胞生長至70%融合時，利用Lipofectamine 2000試劑，在細胞中轉染anti-miR-145-5p、pcDNA-MRGBP、si-MRGBP及其相應陰性對照，并且依照1.2所述方法進行紫外線照射，轉染48 h后，收集細胞，分別根據1.3和1.4中的方法檢測miR-145-5p和MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達。

1.6 噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測細胞增殖 調整SRA01/04細胞密度為1×105個/ml，接種于96孔板，培養48 h后，每孔細胞加入20 μl MTT溶液，反應4 h，之后加入150 μl二甲基亞砜，搖床震蕩反應10 min，于酶標儀讀取細胞490 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞增殖率(%)。細胞增殖率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 SRA01/04細胞凋亡的檢測依照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書的指示，在1×106個/ml密度的SRA01/04細胞中加入500 μl緩沖液，使細胞重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC、5μl PI染色液，分別混勻后于黑暗中反應15 min，置流式細胞儀進行細胞凋亡的檢測。

1.8 生物信息學預測與雙熒光素酶活性檢測 starbase網站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測出miR-145-5p和MRGBP的3’非編碼區(3’untranslated region，3’UTR)具有靶向結合位點。構建含有miR-145-5p結合位點的MRGBP-3’UTR野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體，在SRA01/04細胞中共轉染miR-145-5p和MRGBP野生型及突變型報告基因載體，48 h檢測細胞雙熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-145-5p和MRGBP在晶狀體上皮細胞中的表達 與對照比較，凋亡模型晶狀體上皮細胞SRA01/04中miR-145-5p表達量明顯增加，MRGBP mRNA和MRGBP蛋白表達量顯著減少(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western blot檢測MRGBP蛋白表達

表1 miR-145-5p和MRGBP在晶狀體上皮細胞中的表達

2.2 低表達miR-145-5p對晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響 與對照比較，凋亡模型SRA01/04細胞中miR-145-5p表達量明顯增加，cyclinD1表達量、細胞增殖率顯著減少，C-caspase-3水平、細胞凋亡率明顯提高(P<0.05)。與凋亡模型+anti-miR-NC比較，低表達miR-145-5p顯著減少凋亡模型SRA01/04細胞的miR-145-5p表達量，明顯增加cyclinD1表達量、細胞增殖率，以及顯著降低C-caspase-3水平、細胞凋亡率(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 低表達miR-145-5p對晶狀體上皮細胞凋亡及cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡;B Western blot檢測cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

表2 低表達miR-145-5p對晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響

2.3 高表達MRGBP對晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響 與凋亡模型+pcDNA-NC比較，高表達MRGBP明顯增加凋亡模型SRA01/04細胞中MRGBP蛋白表達量、cyclinD1蛋白表達量、細胞增殖率，而顯著降低C-caspase-3蛋白水平、細胞凋亡率(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 高表達MRGBP對晶狀體上皮細胞增殖和凋亡的影響

圖3 Western blot檢測MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.4 miR-145-5p靶向調控MRGBP表達 Starbase預測發現，miR-145-5p和MRGBP的3’UTR部分堿基存在互補配對現象。相比于miR-NC和WT(MRGBP)共轉染，miR-145-5p與WT(MRGBP)共轉染的SRA01/04細胞熒光素酶相對活性明顯降低(P<0.05)；miR-NC或miR-145-5p與MUT(MRGBP)共轉染后，SRA01/04細胞熒光素酶相對活性無顯著變化。與miR-NC比較，miR-145-5p組MRGBP蛋白表達量明顯減少；與anti-miR-NC比較，anti-miR-145-5p組MRGBP蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖4。

表4 miR-NC或miR-145-5p與報告質粒共轉染SRA01/04細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 Western blot檢測MRGBP的表達

圖4 miR-145-5p靶向調控MRGBP表達;A starbase對miR-145-5p和MRGBP結合的預測示意圖;B Western blot檢測MRGBP表達量

2.5 低表達MRGBP可以逆轉miR-145-5p低表達對晶狀體上皮細胞凋亡模型增殖和凋亡的影響 與凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-NC比較，凋亡模型+anti-miR-145-5p+si-MRGBP組SRA01/04細胞的MRGBP、cyclinD1蛋白表達量、細胞增殖率明顯減少，C-caspase-3蛋白水平、細胞凋亡率顯著提高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Western blot檢測MRGBP、cyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

表6 低表達MRGBP可以逆轉miR-145-5p低表達對晶狀體上皮細胞凋亡模型增殖和凋亡的影響

3 討論

白內障仍然是導致患者視力障礙和失明的主要原因。目前，手術干預是治療白內障的有效方法。然而，人口特點和高昂的手術費用給社會帶來了巨大的經濟負擔，尤其是在發展中國家。此外，患者也可能發生不可逆的手術相關并發癥[13]。因此，為了預防或延緩白內障的發生發展，仍需要新的治療策略。晶狀體上皮細胞在晶狀體整個生命周期中負責晶狀體纖維的分化。正確的晶狀體上皮細胞分化和形態維持晶狀體的正常透明，而晶狀體上皮細胞內的發育、增殖、分化、凋亡等的病理變化可能導致白內障[14,15]。本研究以晶狀體上皮細胞SRA01/04為對象，利用紫外線照射建立細胞凋亡模型，發現與對照比較，凋亡模型晶狀體上皮細胞SRA01/04中細胞增殖率、cyclinD1表達量顯著減少，細胞凋亡率、C-caspase-3水平明顯提高，與前人報道[16,17]相符。

miRNA是一類內源性非編碼RNA，通過與靶mRNA 3，UTR的互補序列結合，可以誘導其降解或翻譯抑制[18]。研究表明，一些miRNA與白內障的發生有關，提示miRNA可能成為白內障診斷和治療的新靶點[19,20]。Lu等[21]發現miR-24在年齡相關性白內障和氧化應激刺激的晶狀體上皮細胞中表達顯著增加，參與年齡相關性白內障形成的新機制。Chen等[22]報道了miR-26a和miR-26b可以抑制晶狀體上皮細胞的增殖、遷移和晶狀體的體內外纖維化。根據報道，miR-145-5p被認為具有抑癌作用，可以抑制腫瘤細胞增殖，促進癌細胞凋亡，抑制體內外腫瘤發生[23-25]。此外，miR-145-5p參與一些眼科疾病進展，在小鼠視網膜組織中，miR-145-5p表達上調，并通過下調β-連環蛋白(β-catenin)的表達影響眼軸的增長[26]。然而，miR-145-5p在白內障中的作用尚未見報道。本研究發現，miR-145-5p的生物學功能和分子機制與白內障的進展相關。與對照比較，凋亡模型晶狀體上皮細胞SRA01/04中miR-145-5p表達明顯上調，低表達miR-145-5p顯著增加凋亡模型SRA01/04細胞的增殖率、cyclinD1表達量，顯著降低細胞凋亡率、C-caspase-3水平。說明miR-145-5p影響白內障的進展，下調miR-145-5p在凋亡模型晶狀體上皮細胞中表現出促進增殖和抑制凋亡的功能，與Zhang等[10]的研究相似。

本實驗中，凋亡模型晶狀體上皮細胞SRA01/04中MRGBP mRNA、MRGBP蛋白表達量顯著減少，提示MRGBP可能在晶狀體上皮細胞生物學過程中發揮重要作用。MRGBP也稱為20號染色體開放閱讀框20，是編碼包含組蛋白乙酰轉移酶復合物的轉化/轉錄域相關蛋白(TRRAP)/tat相互作用蛋白60(TIP60)的一個亞基[27]。MRGBP已被證明在肺腫瘤組織中異常升高[28]，通過發揮其在細胞增殖和(或)癌細胞分裂方面的優勢而促進結直腸癌的發生[27]。然而MRGBP對白內障的影響尚不清楚。本研究的功能實驗結果顯示，高表達MRGBP顯著增加凋亡模型SRA01/04細胞的增殖率、cyclinD1表達量，明顯降低細胞凋亡率、C-caspase-3水平。表明MRGBP對凋亡模型晶狀體上皮細胞具有一定的保護作用，可以促進細胞增殖并誘導凋亡。生物信息學數據庫用于預測miR-145-5p在MRGBP 3，UTR中的可能結合位點。進一步的實驗表明，miR-145-5p可直接靶向MRGBP的3，UTR并降低其表達。同時，低表達MRGBP可以逆轉miR-145-5p低表達促進凋亡模型中SRA01/04細胞增殖、cyclinD1蛋白表達的作用，以及逆轉了其抑制細胞凋亡、C-caspase-3蛋白表達的作用。這些結果證實，miR-145-5p對凋亡模型晶狀體上皮細胞的增殖和凋亡的影響可能是通過靶向調控MRGBP的表達來實現的。

綜上所述，miR-145-5p在凋亡模型晶狀體上皮細胞中表達明顯上調，低表達miR-145-5p能夠促進細胞增殖，和抑制細胞凋亡，其作用機制與靶向調控MRGBP的表達有關，為白內障的臨床診治提供了新的見解。