TPT1-AS1靶向miR-30c對肺癌細胞發生發展的影響

符國奮 梁海梅 王志峰 顏洪順 符之月

肺癌是全球常見且病死率較高的惡性腫瘤，分子靶向治療是新的治療方式，也是未來研究的熱點和重點，其可針對性的通過特異性靶點進行治療[1]。因此，尋找特異性靶點是分子靶向治療的關鍵和重點。研究表明，lncRNA參與肺癌的發生發展過程，可作為肺癌的分子標志物[2]。腫瘤翻譯調控蛋白1(tumor protein translationally-controlled 1，TPT1)反義RNA1(TPT1 antisense RNA 1，TPT1-AS1)是一種lncRNA，研究報道TPT1-AS1在非小細胞肺癌中高表達，與TNM分期、淋巴轉移及患者生存率相關，可作為臨床預后判斷的參考指標[3]。TPT1-AS1在上皮性卵巢癌轉移組織和細胞系中也高表達，與FIG0分期，腫瘤大小和腫瘤分化密切相關；TPT1-AS1通過誘導TPT1表達促進細胞增殖，遷移和侵襲[4]。然而TPT1-AS1對肺癌細胞發生發展的影響及機制尚不清楚。研究報道miRNA也參與了腫瘤的發生發展，研究報道miR-30c的低表達通過誘導非小細胞肺癌的上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)促進細胞侵襲[5]。lncRNA DLEU2通過下調miR-30c-5p可促進非小細胞肺癌細胞的增殖和侵襲[6]。但TPT1-AS1是否通過調控miR-30c影響肺癌的發生發展還不清楚。因此，本實驗旨在研究TPT1-AS1對肺癌細胞發生發展的影響及機制是否與miR-30c有關。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取瓊海市人民醫院2017年1月至2019年1月收治的肺癌患者34例，患者經手術切除癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的為癌旁組織。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①經病理組織切片檢測確診為肺癌；②術前未進行過放化療；③臨床病理及隨訪資料完整；④患者均知情且同意。

1.2.2 排除標準：①心、肝臟、腎等功能不齊全者；②患有嚴重精神疾病者；③合并其他腫瘤者。

1.3 材料 肺癌細胞A549購自上海酶研生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海羽朵生物科技有限公司；吉姆薩染色液購自北京華邁科生物技術有限責任公司；Transwell小室購于美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.4 細胞培養與分組 肺癌細胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37℃、5% CO2條件下培養，2 d換液1次，取對數生長期細胞進行實驗，將pcDNA3.1、pcDNA3.1-TPT1-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-30c分別轉染至A549細胞中，記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TPT1-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-30c組。

1.5 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測TPT1-AS1和miR-30c表達水平 各組細胞培養48 h，提取總RNA，將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。TPT1-AS1和miR-30c分別以GAPDH和U6為內參，TPT1-AS1上游引物序列：5’-CTCCCAA

AGTGCTGGGATTA-3’，下游引物序列：5’-TTTAGGAA

GATGGGCAAGGA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3’，下游引物序列：5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’；miR-30c上游引物序列：5’-TGTAAACATCCTACACTCTCAGCAA-3’，下游引物序列：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期 2組細胞培養48 h后收集細胞，并制備單細胞懸液，加入3 ml預冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A(RNase A)于37℃水浴30 min，加入碘化啶(PI)，避光30 min，上機檢測，重復3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行檢測分析。

1.7 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 取對數生長期A549細胞，制成1×104個/ml細胞懸液，以每孔100個細胞接種于六孔板中，每組設3個復孔，培養2周出現肉眼可見克隆時終止培養，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數>50個細胞的集落。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)法檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS-PAGE、轉膜、封閉，加入將稀釋好的一抗(1∶500稀釋)，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，加入按照1∶3 000稀釋的HRP標記山羊抗兔的二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值。實驗重復3次。

1.9 Transwell檢測細胞遷移 Transwell小室上室加100 μl細胞懸液，下室加500 μl含血清培養液，37℃培養24 h，取出培養板，0.1%結晶紫染色30 min，PBS漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層細胞，光學顯微鏡(×200)下隨機選擇5個視野，拍照記錄并進行細胞計數。實驗重復3次。

1.10 熒光素酶報告實驗檢測TPT1-AS1對miR-30c的靶向調控 構建含miR-30c結合位點的TPT1-AS1的野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-TPT1-AS1和MUT-TPT1-AS1，用LipofectamineTM 2000將WT-TPT1-AS1和MUT-TPT1-AS1分別與miR-NC和miR-30c共轉染至A549細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

2 結果

2.1 TPT1-AS1在肺癌中的表達 與癌旁組織比較，肺癌組織中TPT1-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 TPT1-AS1的表達

2.2 過表達TPT1-AS1對A549增殖的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組G0期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，S期細胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2期細胞所占比例差異無統計學意義(P>0.05)；細胞克隆形成數顯著升高(P<0.05)，Ki67表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 Ki67蛋白的表達

表2 過表達TPT1-AS1對A549增殖的影響

2.3 過表達TPT1-AS1對A549遷移的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組TPT1-AS1表達水平顯著升高，遷移細胞數顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低，N-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 過表達TPT1-AS1對A549遷移的影響

圖2 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

2.4 TPT1-AS1靶向miR-30c Starbase數據庫預測顯示TPT1-AS1與miR-30c存在結合位點。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC組比較，miR-30c組中轉染野生型表達載體WT-TPT1-AS1的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉染突變型表達載體MUT-TPT1-AS1的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TPT1-AS1組miR-30c表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 TPT1-AS1靶向miR-30c

表4 TPT1-AS1靶向miR-30c

表5 TPT1-AS1調控miR-30c

2.5 抑制miR-30c對A549增殖、遷移的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-30c組miR-30c表達水平顯著降低，G0期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2期細胞所占比例變化差異無統計學意義(P>0.05)；細胞克隆形成數顯著升高，遷移細胞數顯著升高，Ki67、N-cadherin表達水平顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

表6 抑制miR-30c對A549增殖、遷移的影響

表7 Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達

3 討論

隨著分子生物學的發展，腫瘤靶向藥物逐漸成為腫瘤治療的研究熱點，越來越多的靶向藥物進入臨床；研究肺癌的發生發展機制有利于尋找新的靶點以用于開發新的靶向藥物[7]。研究表明lncRNA與腫瘤的發生發展密切相關，深入研究lncRNA在腫瘤中的作用機制，可能為腫瘤診療提供新的方法[8]。研究報道lncRNA TPT1-AS1在膠質母細胞瘤中差異表達，是膠質母細胞瘤中臨床相關的lncRNA生物標記[9]。神經膠質瘤細胞中TPT1-AS1上調表達，TPT1-AS1可以競爭性地結合miR-770-5p，從而調節STMN1的表達。以抑制神經膠質瘤細胞自噬并促進增殖[10]。TPT1-AS1在子宮頸癌組織和細胞系中表達上調，高表達的TPT1-AS1與患者不良預后特征和不良生存率顯著相關，TPT1-AS1的過表達通過充當miR-324-5p的海綿可促進子宮頸癌細胞的細胞集落形成、增殖、遷移、侵襲和EMT進程[11]。本實驗結果表明肺癌組織中TPT1-AS1高表達，說明TPT1-AS1可能參與了肺癌的進展。為進一步研究TPT1-AS1對肺癌的影響，轉染TPT1-AS1過表達載體，結果顯示，G0期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高，G2期細胞所占比例無顯著變化；細胞克隆形成數顯著升高，遷移細胞數顯著升高，Ki67、N-cadherin表達水平顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低。Ki67是細胞增殖標志物，N-cadherin、E-cadherin是EMT過程的標志物，其表達水平與細胞遷移有關。因此，本實驗結果表明，TPT1-AS1過表達可促進肺癌細胞從G0期到S期轉化，促進細胞的克隆形成和遷移。

研究表明miRNA參與調控腫瘤的侵襲轉移等進展[12]。研究報道胰腺癌組織中miR-30c低表達，高表達可抑制胰腺癌細胞的增殖，并預示預后不良[13]。miR-30c過表達直接靶向BCL9抑制了大腸癌的增殖[14]。miR-30c通過靶向Y染色體上的性別決定區相關高遷移率族盒蛋白9(sex determining region Y-related high mobility group box protein 9，SOX9)可抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖和遷移[15]。miR-30c的下調通過靶向轉移相關蛋白1(metastasis-associated protein 1，MTA1)促進非小細胞肺癌的侵襲[16]。本實驗轉染miR-30c抑制表達載體后，G0期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高，G2期細胞所占比例無顯著變化；細胞克隆形成數顯著升高，遷移細胞數顯著升高，Ki67、N-cadherin表達水平顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低。說明抑制miR-30c表達可促進肺癌細胞增殖和遷移，與前人研究結果相符。且本實驗還發現TPT1-AS1可靶向調控miR-30c的表達。

提示，過表達TPT1-AS1可能通過下調miR-30c促進肺癌細胞從G0期到S期轉化，促進細胞的克隆形成和遷移。