ABCC11基因多態性對非小細胞肺癌患者S-1輔助化療預后的價值分析

邢國柱 沈會華 李悟

肺癌是世界上最常見的癌癥相關死亡原因[1]。為了預防肺癌復發，臨床上已建立了非小細胞肺癌(NSCLC)術后ⅠB～ⅢA期患者的輔助化療方案[2,3]。目前所使用的輔助化療的標準方案是靜脈注射順鉑，另一種輔助性化療藥物為尿嘧啶-喃氟啶，是5-氟尿嘧啶(5-Fu)的前體藥物，這種口服藥物也已被證明也對IB期肺腺癌的治療有效[4]。S-1是另一種口服氟嘧啶衍生物，由替加氟、5-氯-2,4-二羥基吡啶(CDHP)和氧酸鉀(Oxo)3種成分組成[5]。以S-1為基礎的化療在輔助治療中起到的積極作用已在多種癌癥治療中得到證實，包括胃癌、胰腺癌、結腸癌等[6-8]。ABCC11基因位于16號染色體上，是ATP結合盒轉運蛋白超家族的一員，編碼多耐藥相關蛋白8(MRP8)，其對腋窩頂泌腺和初乳分泌功能具有重要的意義，且已有研究證明其參與調節5-Fu代謝[9,10]。5-Fu及其衍生物在細胞內被代謝為5-氟-2’-脫氧尿苷5’-單磷酸(FdUMP)，FdUMP被ABCC11/MRP8主動轉運出細胞。ABCC11基因中的單核苷酸多態性(SNP)，例如538G/A，G180R，對分泌位置及功能具有重要作用，并且決定耳垢干濕性[11,12]。A/A等位基因型對應于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型對應于濕性耳垢。因此，這些數據表明，調節耳垢類型的SNP538可能預測5-Fu的療效。本研究為了闡明S-1輔助化療后，ABCC11基因多態性對ⅠB～ⅢA期NSCLC預后的影響，究了肺癌患者5年生存率及其與臨床病理因素的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年2月至2015年9月在本院診治的60例NSCLC患者作為研究對象，其中男40例，女20例；平均年齡(58.4±10.2)歲，患者均要求符合以下標準：有組織學證據證明患者為非小細胞肺癌；根據國際抗癌聯盟(UICC)/美國癌癥聯合委員會(AJCC) 1997年第5版指南，非小細胞肺癌完全切除后病理分期為ⅠB、Ⅱ或ⅢA；除手術外，未接受其他治療；年齡20～80歲，有足夠的口服攝取量，且表現狀態(PS)為0或1[14]。所有患者進行了肺葉切除手術。患者均簽訂知情同意書，本研究同時經醫院倫理道德委員會通過。見表1。

表1 非小細胞肺癌患者的基本特征

1.2 方法

1.2.1 治療計劃如下：化療包括8個療程，根據患者體表面積(BSA)的不同，S-1的給藥劑量為80～120 mg/d。BSA <1.25 m2時,80 mg/d；1.25 m2≤BSA <1.5 m2時，100 mg/d，BSA≥1.5 m2，120 mg/d。S-1在術后4周內開始口服，2次/d，飯后服用。

1.2.2 使用QIAamp DNA迷你試劑盒(Qiagen,上海)按照說明書中描述的方法，從2～3個連續的10 mm切片中提取DNA。采用突變富集—多聚酶鏈反應—限制性片段長度多態性技術對突變熱點進行了分析。

1.2.3 胸苷合酶(TS)、乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRT)、DPD的免疫組化染色。制備5 mm厚的腫瘤切片進行免疫組化染色。采用1∶1 000濃度的原代多克隆抗體(APExBIO，上海)結合DPD、OPRT和TS。以生物素化抗兔免疫球蛋白G和過氧化物酶標記鏈霉親和素(Bersee，北京)為二抗檢測DPD。采用Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector，上海)作為檢測TS和OPRT的二抗。使用3,3’-二氨基聯苯胺觀察抗體結合。腫瘤細胞免疫染色強度分為：0(無染色)、D1(弱染色)、D2(明顯染色)、D3(強染色)。0級和1級進一步分為陰性，2級和3級為陽性。

1.3 統計學分析 采用JMP 11.0軟件進行數據分析，采用Kaplan-Meier方法預測無復發生存期(RFS)和總生存期(OS)的時間-事件函數。RFS定義為從開始治療之日起至最早出現復發之日或死亡之日(以先發生者為準)。OS定義為從開始治療之日起至死亡或最后一次接觸之日止的時間。log-rank檢驗用于檢驗預測時間-事件曲線之間可能存在的差異。單因素的預后相關性由多因素Cox回歸分析確定。采用χ2檢驗分析復發和臨床病理因素之間的關聯。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5年生存率與臨床病理因素相關性分析 在隨訪的60例患者中，16例死亡，44例分析時仍存活。5年的OS為73.3%。在16例死亡患者中，有11例在死亡前有復發記錄，其余4例患者中，1例死于膽管癌，1例死于腦梗死，2例死于惡性淋巴瘤，1例死于腹膜癌。5年的RFS為69.5%。見圖1。

圖1 ⅠB～ⅢA期NSCLC患者接受S-1化療后的5年OS(a)和RFS(b)

2.2 5年單因素分析 根據臨床病理特點列出了5年的OS和RFS。OS單因素分析發現，鱗狀細胞癌患者的OS比肺腺癌患者短(P=0.032)；腫瘤≥34 mm

的患者相較于腫瘤≤33 mm的患者OS也短 (P=0.013)。RFS單因素分析發現，功能狀態評分(PS)≥1 (P=0.031)、淋巴管浸潤(P=0.005)、血管浸潤(P=0.003) 以及A/A型SNP538 (P=0.012)均表現出較短的生存時間。見表2。

表2 根據臨床病理特征對非小細胞肺癌患者進行5年生存率分析

2.3 ABCC11基因與患者預后的關系 從接受S-1治療的60例患者中挑選出40例療效達到或超過70%的患者，對其5-年存活率進行分析，結果顯示，A/A型SNP538(P=0.003)、TS 免疫組化結果為陰性(P=0.018)以及PS≥1(P=0.026)均為RFS較差的顯著預測因子。多因素Cox回歸分析發現只有A/A型SNP538表現出顯著的危險比(P=0.002)。見圖2，表3。

表3 根據40例S-1療效較好的患者的臨床病理特點進行單因素和多因素RFS分析

3 討論

本研究中，S-1治療NSCLS后5年OS和RFS發生率較高；ⅠB至ⅢA期患者的OS和RFS分別為73.3%和69.5%，與以往的研究結果[3]相當。雖然S-1在術后輔助治療中具有較高的療效，但是其確切作用機制尚不明晰。眾所周知，尿嘧啶-喃氟啶的毒性極低，因此很適合作為口服藥物長期(2年)使用，在此期間，它達到足夠量的5-Fu，進而防止癌癥復發或轉移。由于S-1是一種類似的口服氟嘧啶，其1年的給藥可能通過相同的機制導致良好的預后。以S-1為基礎的化療在輔助治療中起到的積極作用已在多種癌癥治療中得到證實，包括胃癌、胰腺癌、結腸癌等[9-11]。與此同時，研究者還開展了基于S-1的NSCLC ⅠB期至ⅢA期輔助化療的可行性研究，研究表明基于S-1的輔助化療在ⅠB至ⅢA期NSCLC中均是可行的[13-15]。此外，口服藥物治療能夠在門診進行，可以維持患者的生活質量。

就治療策略而言，以S-1為基礎的治療作為術前輔助化療也具有一定的優勢。在S-1治療過程中，5-Fu代謝物FdUMP與TS形成極其穩定的三元復合物，阻斷dUMP的甲基化，并且也阻止了dUMP轉化為DNA合成所必需的dTMP[16,17]。因此，S-1抗癌作用的主要機理是抑制細胞分裂。另一方面，鉑以幾種不同的方式與DNA交聯，通過干擾有絲分裂影響細胞分裂，破壞DNA結構，并引發DNA修復機制，進而激活細胞凋亡[18]。鑒于這些藥物具有不同的抗癌機制，以S-1為主要的輔助化療手段，復發后選擇鉑偶聯治療可能會有更好的療效。

本研究的生存分析表明，較低的PS和淋巴管及血管浸潤與較短的RFS時間有關。這些結果與以往研究的結果一致，血管浸潤性腫瘤具有侵襲性生長以及轉移的潛能，導致患者的預后不良[19]。A/A型SNP538也與較短的RFS有關，多因素生存分析表明，A/A型SNP538表現出統計學上較為顯著的危險比。已有研究表明,ABCC11基因中的SNP538決定了耳垢的類型[19]。A/A等位基因型對應于干性耳垢，G/G和G/A等位基因型對應于濕性耳垢。由于G/G或G/A型SNP538患者沒有復發，這一結果顯示耳垢類型可以作為基于S-1的輔助化療療效的生物標志物。這些等位基因的頻率存在較大的種族差異[20]，這表明基于S-1化療的療效也存在種族差異。然而，ABCC11基因的SNP538影響S-1輔助化療患者預后的機制尚難解釋。在一項基于細胞的研究中顯示，ABCC11通過增強細胞內抗癌藥物的外流，直接對培美曲塞產生耐藥性。此外，A/A組培美曲塞的IC50較G/G或G/A組顯著降低，說明A/A型SNP538患者對培美曲塞更為敏感[21]。在本研究中，A/A型患者的RFS率低于G/A或G/G型患者。有可能是因為S-1在活細胞中的積累，影響A/A型SNP538患者體內的穩態平衡，從而導致癌癥的復發。低TS的表達與復發之間也存在關聯。本研究的結果表明，接受S-1治療的患者中，高TS表達組比低表達組表現出更好的RFS。以往也有很多研究表明，高TS表達確實可以預測良好的預后。Fujiwara等[21]利用老鼠模型，發現在高TS表達水平的胃癌中，S-1比5-Fu和尿嘧啶-喃氟啶的抗腫瘤療效更好。我們推測S-1較高的DPD抑制作用增加了5-Fu代謝物的細胞內水平，并通過TS失活誘導TS成癮性癌細胞的細胞毒性。

綜上所述，本研究的5年生存率分析表明ABCC11基因中的A/A型SNP538是術后患者接受S-1輔助治療是否會復發的重要預測因子。由于A/A型SNP538對應于干型耳垢，因此基于S-1的輔助化療可能因耳垢類型的不同而產生個性化差異。