LINC00087靶向miR-519d-3p對膠質瘤細胞增殖凋亡的影響

劉恩智 邵曉光 盛巍 李勐

膠質瘤(glioma)是常見的原發性顱內惡性腫瘤，其中膠質母細胞瘤是最惡性的形式(WHO IV級)，并以治療耐藥性而臭名昭著[1]。發現膠質瘤的抑制基因，開發更為個性化的精準靶向治療方法對膠質瘤患者的治療具有重要意義[2]。研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)可能與微小RNA(microRNA，miRNA)相關作用，通過MAPK、p53、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR和上皮間質轉化(EMT)等信號通路的激活參與了膠質瘤的生長和進展[3]。研究表明，長基因間非編碼RNA00087(LINC00087)在神經膠質瘤組織中高表達，可能是疾病的預后指標或治療靶點[4]。本研究通過TargetScan預測發現，miR-519d-3p與LINC00087存在結合位點。miR-519d-3p在膠質瘤組織和細胞系中的表達顯著降低，miR-519d-3p的過表達抑制細胞增殖并誘導細胞周期G0/G1期阻滯[5]。但LINC00087和miR-519d-3p在膠質瘤中的關系目前還尚不清楚。本研究檢測膠質瘤組織中LINC00087的水平，然后以人膠質瘤細胞系U251為主要研究對象，檢測LINC00087和miR-519d-3p對膠質瘤細胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 一般情況：選取2018年1～12月于我院病理檢查確診為膠質瘤的患者手術切除的膠質瘤組織共45例，其中男25例，女20例；年齡19～69歲，平均年齡(46.0±12.2)歲；病理級別：WHO Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ～Ⅳ級21例。患者術前未接受放療和化療。同時選擇40例志愿者(腦外傷行顱內減壓手術患者)正常腦組織作為對照。

1.1.2 儀器與試劑：人膠質瘤細胞株U251購自美國ATCC；胰蛋白酶、RNA提取試劑Trizol購自美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養液培養基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；CCK8檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；引物、LINC00087抑制物(si-LINC00087)、miR-519d-3p模擬物(miR-519d-3p)、miR-519d-3p抑制劑(anti-miR-519d-3p)、陰性對照(si-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、LINC00087野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；Ki67、Caspase3和GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司；雙熒光素酶報告系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將膠質瘤細胞U251常規復蘇，然后接種培養在含10% FBS的DMEM高糖培養液中，培養液中添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，然后置于37℃ 5% CO2培養箱中培養，消化傳代。

1.2.2 Real-time PCR檢測LINC00087和miR-519d-3p的表達:用Trizol試劑提取膠質瘤組織樣本、正常腦組織及U251細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進行反應，合成lncRNA LINC00087和miR-519d-3p。引物如下：LINC00087上游： 5’-GTCCCAAGTCTCCTGAGAAC-3’,下游5’-CCAGCTCTGTATCACTCTTG-3’；GAPDH上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-519d-3p上游：5’-GACCAAAGTGCCTCCCTTTA-3’，下游：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游： 5’-AACGCTTACGAATTTGCGT-3’。應用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.2.3 細胞轉染:將U251細胞稀釋為2×106個/ml，以100 μl細胞/孔的密度接種于6孔板中，細胞培養至融合度達到70%時，根據轉染說明書轉染U251細胞。將si-NC、si-LINC00087、miR-NC、miR-519d-3p、si-LINC00087+anti-miR-NC、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p分別轉染至U251細胞，分別為：si-NC組、si-LINC00087組、miR-NC組、miR-519d-3p組、si-LINC00087+anti-miR-NC組、si-LINC00087+anti-miR-519d-3p組。轉染48 h，收集細胞進行驗證。

1.2.4 CCK8實驗檢測細胞增殖:收集并稀釋對數生長期的U251細胞，以2×103個細胞/孔(以100 μl細胞)接種于96孔板中，在37℃ 5% CO2培養箱中培養，在培養至48h時每孔加入10 μl CCK8溶液，培養2 h，酶標儀測定450 nm 吸光度(A)值。存活率%=實驗組A組/對照組A值×100%。

1.2.5 Western Blot實驗檢測蛋白:收集轉染后的各組U251細胞，裂解后提取細胞總蛋白，檢測蛋白濃度。用SDS-PAGE分離蛋白樣本，轉PVDF膜，然后將膜室溫封閉1 h，洗膜后分別加入稀釋的一抗，Ki67抗體(1∶1 000)、Caspase3抗體(1∶2 000)和GAPDH抗體(1∶4 000)，4℃過夜孵育。洗膜2次，然后加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育2 h，顯影，拍照。以GAPDH為內參照，分析蛋白表達水平。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組轉染的U251細胞，稀釋為1×106個細胞/管，按照凋亡試劑盒說明書進行操作，加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光15 min，上流式細胞儀檢測檢測細胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗:根據1.2.3的方法進行細胞轉染，將構建好的LINC00087的野生型(WT-LINC00087)和突變型(MUT-LINC00087)雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-519d-3p共轉染U251細胞，轉染48 h后，收集并裂解細胞，離心收集裂解上清，根據試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

2 結果

2.1 LINC00087在膠質瘤組織中的表達 與正常腦組織相比，膠質瘤組織組中的LINC00087水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA LINC00087在膠質瘤組織中的表達

2.2 抑制LINC00087對U251增殖的影響 膠質瘤U251細胞中轉染si-LINC00087抑制LINC00087的表達，si-LINC00087組的膠質瘤U251細胞中LINC00087含量降低，細胞存活率和增殖蛋白Ki67含量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。說明抑制LINC00087可以抑制U251細胞增殖。見表2，圖1。

表2 抑制LINC00087對U251增殖的影響

圖1 Ki67蛋白的表達

2.3 抑制LINC00087表達對膠質瘤U251細胞凋亡的影響 si-LINC00087組的U251細胞中Caspase3蛋白表達量增多，細胞凋亡率升高，差異均具有統計學意義(P<0.05)。說明抑制LINC00087可促進U251細胞凋亡。見圖2，表3。

圖2 抑制LINC00087對U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表達(B)的影響

表3 抑制LINC00087對U251凋亡的影響

2.4 LINC00087靶向調控miR-519d-3p的表達 TargetScan預測發現，lncRNA LINC00087與miR-519d-3p之間存在互補的位點。雙熒光素酶報告實驗結果表明，過表達miR-519d-3p組共轉染野生型WT-LINC00087報告載體的細胞熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)；而共轉染突變型MUT-LINC00087的細胞熒光素酶相對活性無顯著變化。qRT-PCR結果表明，抑制lncRNA LINC00087可上調miR-519d-3p含量(P<0.05)。說明lncRNA LINC00087靶向負調控miR-519d-3p的表達。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 lncRNA LINC00087調控miR-519d-3p的表達

圖3 LINC00087靶向miR-519d-3p

2.5 抑制miR-519d-3p表達逆轉了抑制LINC00087表達對膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的作用 為確認LINC00087通過調控miR-519d-3p影響膠質瘤細胞U251的增殖和凋亡，在抑制LINC00087的同時抑制miR-519d-3p。與si-LINC00087+anti-miR-NC組相比，si-LINC00087+anti-miR-519d-3p組的U251細胞中miR-519d-3p的含量降低，細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，Ki67蛋白含量升高，Caspase3蛋白含量降低，均具有統計學意義(P<0.05)。說明抑制miR-519d-3p可逆轉抑制LINC00087對U251細胞增殖和凋亡的影響。見表6，圖4。

表6 抑制miR-519d-3p表達逆轉了抑制LINC00087對細胞U251增殖和凋亡的影響

圖4 U251凋亡(A)及Caspase3蛋白表達(B)的影響

3 討論

膠質瘤是是中樞神經系統中最具侵襲性的腦腫瘤，轉移和擴散能力較高，高級膠質瘤患者總生存期大約只有15個月[6]。大量研究表明，包括lncRNA和miRNA在內的非編碼RNA在膠質瘤的發生、發展及腫瘤分型中發揮關鍵作用[4-8]。

有研究表明，基因間lncRNA LINC00087在膠質瘤組織中表達呈現顯著上調，且其表達水平在高級別膠質瘤組織中明顯高于低級別膠質瘤組織，說明LINC00087可能是與患者預后有關的生物標志物[4]。但是筆者發現其在膠質瘤中的作用機制尚不清楚，在別的癌癥中的研究較少。本研究通過檢測45例膠質瘤組織和正常腦組織發現，與正常腦組織相比，LINC00087在膠質瘤組織中含量顯著升高，與上述結果[4]一致；在膠質瘤U251細胞中轉染si-LINC00087抑制LINC00087表達，結果發現，LINC00087含量降低后，膠質瘤U251細胞中增殖蛋白Ki67含量降低，細胞存活率降低，細胞凋亡率和凋亡蛋白Caspase3水平均升高，說明抑制LINC00087可抑制U251細胞增殖并促進細胞凋亡。

此外，本研究通過TargetScan預測發現，miR-519d-3p與LINC00087存在互補的位點，說明LINC00087與miR-519d-3p之間可能是靶向結合關系。雙熒光素酶報告系統和qRT-PCR實驗結果表明，LINC00087靶向負調控miR-519d-3p的表達。miR-519d-3p在乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]、結直腸癌[10]和胰腺癌[11]等組織或細胞中表達顯著下調，發揮腫瘤抑制因子的作用，上調其表達可靶向不同的基因抑制癌細胞的增殖和侵襲。研究發現，miR-519d-3p在膠質瘤中表達下調，靶向細胞周期蛋白D1(CCND1)調控癌細胞的增殖和細胞周期進程[5]。本研究中還發現，抑制LINC00087可上調miR-519d-3p含量，說明miR-519d-3p和LINC00087在膠質瘤細胞中表達呈負向關系。進一步實驗發現，抑制miR-519d-3p可逆轉抑制LINC00087對U251細胞增殖和凋亡的影響，間接驗證了在膠質瘤U251細胞中LINC00087對miR-519d-3p的調控關系。

綜上所述，在膠質瘤組織中LINC00087上調，在膠質瘤U251細胞中，LINC00087靶向miR-519d-3p調控U251細胞增殖和凋亡。 LINC00087是膠質瘤的潛在分子靶點。