丹參素與小鼠心臟中的內質網Ca2+滲漏通道SEC61α相互調節心肌梗死后纖維化的作用

劉俊雄 王毅

心肌梗死是目前較為常見且預后較差、病情危險的一種疾病[1]。若治療不及時，很容易造成嚴重后果，且每年因此造成的死亡或殘疾人數，不僅給家庭和社會造成巨大負擔，也嚴重影響著患者的身心健康和生活質量[2]。心肌梗死后的心肌纖維化屬于機體心力衰竭、心臟肥大的一種病理學特征，主要表現為機體心臟大量膠原蛋白、細胞質基質的沉積及纖維細胞的大量增殖[3]。目前，臨床上對于心肌梗死治療的效果較為顯著，在一定程度上降低了患者的病死率，但未達到抑制其心肌纖維發展的目的，最終導致機體因心肌衰竭而出現心律失常、猝死等并發癥。同時，心肌梗死產生的心肌纖維化屬于較為持久，且難以逆轉的病理現象，因此引發的心機重構是機體內多種慢性疾病發生的重要病理學特征，可通過影響器官正常的生理結構，造成器官正常功能異常，嚴重時可致使疾病惡化現象加劇[4]。本文主要通過研究丹參素對心肌梗死小鼠心肌纖維化的影響和作用機制，進而增加心肌梗死纖維化的有效治療的可能性，為臨床提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級C57BL/6小鼠[合格證號：SCXK(粵)2016-0041]，雄性，體重(20±2)g，購自武漢大學下屬機構實驗動物中心。每天定點給予12 h光照時間，飼養環境溫度在(22±3)℃，濕度為55%左右，所有小鼠在實驗期間可自由飲食。

1.2 方法

1.2.1 動物分組:隨機將72只C57BL/6小鼠分成4組，每組18只，分別為假手術組、模型組、卡托普利組和丹參素組。

1.2.2 小鼠心肌梗死模型的建立:取模型組和藥物處理組小鼠，使用40 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉經腹腔注射將其麻醉后，通過氣管插管后給予呼吸器，并使用室內空氣進行輔助通氣，其中通氣參數設置為：呼吸頻率68 cylces/min，潮氣量8 ml/100 g。使用75%乙醇消毒后，從小鼠第四肋骨位置處進行胸廓切手術。利用錐形針，將1-0的絲線通過小鼠左冠狀動脈開端穿入，使用絲線扎緊形成冠狀動脈閉塞。假手術組處理方式與上述方式相同，但不結扎。

1.2.3 實驗方法:造模成功后，假手術組和模型組給予160 mg·kg-1·d-1的0.9%氯化鈉溶液作為實驗對照，卡托普利組和丹參素組給予等量的丹參素進行灌胃，給藥時間為7周。

1.2.4 小鼠心臟超聲評價:灌胃第7周后，使用40 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉經腹腔注射將其麻醉后，使用超聲系統測量小鼠左心室的收縮末期內徑(LVESd)、射血分數(LVEF)和舒張期末期內徑(LVEDd)及縮短分數(LVFS)。

1.2.5 心重指數測定:末次給藥后，進行小鼠全身稱重并記錄；隨后取小鼠心臟，在相對穩定的空間內稱重并記錄，根據全心重/體重值得到心重指數(CWI)(mg/g)。

1.2.6 羥脯氨酸含量測定:取小鼠心臟，利用羥脯氨酸含量測定試劑盒檢測小鼠心臟內羥脯氨酸含量。

1.2.7 SOD與MDA水平檢測:取小鼠心肌組織，加入0.9%氯化鈉溶液于低溫條件下制成5%勻漿，并以3 000 r/min離心5 min，取上清液保存待用。按照SOD活力測定試劑盒和硫代巴比妥酸法檢測小鼠心肌組織SOD和MDA含量。

1.2.8 組織切片染色:小鼠心臟超聲檢測后，將心臟標本按照Masson染色試劑盒說明書進行染色處理。

1.2.9 Western blot檢測:取小鼠左心室的心肌組織，使用組織蛋白裂解液將其裂解后獲得總蛋白，并使用BSA測定蛋白濃度。取35 μg的總蛋白通過SDS-Page電泳實驗后，根據濕轉法進行轉膜實驗，隨后按照SEC61一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜，顯影的方法，最后將其置于化學發光成像儀上進行呈像。結果利用Image J進行分析。

2 結果

2.1 丹參素對小鼠心功能指標的影響 模型組小鼠LVESd、LVEDd水平均高于假手術組，其LVEF和LVFS水平均低于假手術組(P<0.05)。同時丹參素組小鼠LVESd、LVEDd水平低于模型組，LVEF和LVFS水平均高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 心臟超聲檢測4組小鼠的心臟指標

2.2 丹參素對小鼠心重指數的影響 模型組CWI高于假手術組、卡托普利組和丹參素組小鼠(P均<0.05)，說明丹參素可降低心肌梗死小鼠CWI。見表2。

表2 小鼠心重指數變化

2.3 丹參素對小鼠心臟羥脯氨酸含量的影響 模型組小鼠心肌組織內羥脯氨酸含量高于假手術組和藥物處理組(P均<0.05)，由此可知，丹參素可降低心肌梗死小鼠心肌羥脯氨酸含量水平。見表3。

表3 小鼠心臟羥脯氨酸含量變化

2.4 丹參素對小鼠心臟氧化應激水平的影響 心肌梗死模型組小鼠的SOD水平低于假手術組和藥物處理組(P<0.05)，而MDA水平均高于假手術組和藥物處理組(P<0.05)，根據SOD和MDA測定結果可知，丹參素可降低心肌梗死小鼠的SOD水平，升高小鼠MDA水平。見表4。

表4 SOD和MDA水平測定

2.5 丹參素對小鼠膠原容積分數的影響 模型組小鼠的膠原容積分數高于假手術組和藥物處理組(P均<0.05)，可知丹參素可降低心肌梗死小鼠膠原容積分數。見表5。

表5 小鼠心肌組織膠原容積分數比較

2.6 丹參素對小鼠心臟SEC61α蛋白表達的影響 心肌梗死模型組小鼠SEC61α蛋白相對表達水平高于假手術組和藥物處理組(P均<0.05)，可知丹參素可降低心肌梗死小鼠SEC61α蛋白的相對表達水平。見表6，圖1。

表6 SEC61α蛋白相對表達結果

圖1 Western blot結果；1、2、3、4分別代表假手術組、模型組、卡托普利組和丹參素組小鼠 SEC61α蛋白表達結果

3 討論

內質網屬于真核細胞中用于蛋白合成的一種重要細胞器[5]。當機體出現氧化應激、缺氧、異常糖基化、Ca2+失衡等情況下，機體內存在的未折疊蛋白質增多，造成內質網處理能力失衡，最終導致內質網應激[6]。SEC61屬于內質網膜上可用于雙向性轉運蛋白的異源性復合物[7]。在真核細胞中，SEC61主要由SEC61α、SEC61β和SEC61γ組成的3聚復合物，主要作用是在集體內部形成疏水通道，促進由核糖體合成的多肽由此穿過內質網內部[8]。SEC61α通道蛋白在結構上具有10次可用于跨膜的結構域。研究發現，SEC61α突變可破壞內質網蛋白雙向轉運，誘導機體內質網應激反應的產生[9]。心肌纖維化是心力衰竭和心臟肥大的重要特征，目前，對于心肌梗死理想的治療方式就是抑制機體纖維化水平，促進機體心肌再生。因此，對于控制心肌梗死后機體心肌纖維化水平對于改善心臟功能和心臟重構等具有重要意義。

本研究發現，丹參素可降低心肌梗死小鼠心肌組織LVESd、LVEDd，同時降低心肌梗死小鼠CWI、心肌羥脯氨酸含量、SOD、膠原容積分數和SEC61α蛋白相對表達水平，升高小鼠LVEF、LVFS、MDA水平。

丹參屬于唇形科中的一種鼠尾草屬植物，具有抑制血小板聚集、擴血管、強心、抗炎癥等功效[10]。目前，由丹參制成的丹參注射液已被廣泛用于婦科疾病和心血管疾病的治療中，同時研究發現，丹參素可通過對心臟的保護作用和其抗氧化作用達到抑制機體內出現的心臟肥大[11]。丹參素的抗氧化和心臟保護作用可用于抑制機體心臟肥大[12]。研究發現，丹參素能通過TGF-β1/Smad3通路，達到抑制機體腎纖維化的結果，在其肝纖維化的治療中亦具有顯著的防治效果[13]。在對壓力復合小鼠的研究中發現，壓力負荷小鼠具有顯著的氧化應激反應，在此過程中機體產生較多的超氧化物，刺激機體信號通路的產生，進而導致心肌成纖維細胞的大量增殖，而丹參素可顯著降低氧化應激反應，減少機體膠原蛋白的合成，的同時降低纖維化水平，達到改善小鼠心功能的作用[14]。在利用異丙腎上腺素建立的小鼠纖維化的模型中，發現其CVF、CWI及Hydro均顯著增加，而采用降纖維化藥物作用后，以上指標均顯著下調[15]。研究證實機體氧自由基的大量產生和脂質過氧化但應的發生是導致心肌纖維化水平發展的重要因素[16]。SOD時氧自由基消長情況的直接反映指標，當機體出現纖維化時，SOD活性會明顯降低，從而促使氧自由基的堆積，導致其轉化成羥自由基后可致使心肌細胞膜出現脂質過氧化作用，最終導致心肌損傷[17]。而MDA作為脂質過氧化物，在一定情況下可用于間接反映機體的氧自由基的產生情況[18]。在對葛根素對心肌梗死小鼠作用的研究中發現，葛根素可通過增強小鼠心肌組織SOD活性，降低MDA水平，達到抑制機體纖維化的作用[19]。

綜上所述，丹參素可通過抗氧化、心臟保護及與降低SEC61α蛋白表達等功效，達到改善心肌梗死后出現的心肌纖維化的目的。