顱內動脈瘤患者血清hsa-miR-513b-5p水平及作用機制研究

陳 艷 鄭 崢△ 程 瓊 汪銀洲

1）福建醫科大學省立臨床醫學院，福建 福州350001 2）福建省立醫院，福建 福州350001

顱內動脈瘤（intracranial aneurysm，IA）系顱內局部動脈管壁異常改變而產生的瘤樣突起，主要發生于顱內動脈分叉部位，一部分IA 隨著時間的推移能保持穩定，具有肌內膜增生和組織性血栓的特征；另一部分IA 則會出現血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）死亡、細胞外基質退變，從而引起動脈瘤破裂［1］。IA 在人群中的發病率為1%～6%，IA 破裂是造成蛛網膜下腔出血最常見的原因，病死率＞30%且僅約30%的患者能恢復到獨立生活的程度［2-3］。因此，了解IA 的發病機制，影響IA 發生、發展和破裂的因素尤為重要。

IA的主要病理學特征為內彈性層斷裂及血管中膜平滑肌細胞丟失［4］，作為血管壁主要成分的VSMC的丟失促進了細胞外基質降解和破壞，造成血管內皮功能喪失和動脈瘤破裂，可見VSMC 是IA 的關鍵細胞群，VSMC 活躍有利于修復和維持血管壁完整。因此，VSMC 功能障礙是介導IA 發生發展的關鍵因子［4-8］。近年IA 的遺傳研究發現，包括COL1A2、COL1A2、COL3A1 和COL5A2 基因以及非編碼RNA均與IA的發生相關［9-11］。MicroRNA（miR）是一類小的非編碼RNA，研究表明miR 可作為IA 形成的生物標志物，通過調節VSMC 功能影響IA 發生和發展［12-16］。miR 還具有靶向COL1A1、COL1A2、COL3A1 基因表達的作用［17-18］，miR-513b-5p 可靶向COL1A1 和COL1A2 的3'非翻譯區促進卵巢癌的生長［20］，然而miR-513b-5p 與IA 的關系尚無研究報道。

IA的形成和破裂也與細胞轉移相關，從而誘發血管炎癥［20］。已證明基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）參與IA的血管炎癥調節［21］，腹主動脈瘤患者MMPs mRNA和蛋白表達顯著增加，表明MMPs與動脈瘤相關［20，22］。如先前的結果所示，基于受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（RIP3）的激活，腹主動脈瘤壞死程度升高［23］，RIP3的表達對于確定壞死性細胞命運至關重要［24］。相反，細胞中RIP3的缺乏或細胞中RIP1激酶的抑制可保護細胞免于壞死［24-25］。

本研究假設miR-513b-5p 可以靶向COL1A1 和COL1A2 調節IA 的形成，并可能通過介導細胞死亡和凋亡而導致IA 破裂，進一步確定miR-513b-5p 在RIP1-RIP3-MLKL 途徑和細胞外MMPs 重建中的靶標功能，旨在探討血清hsa-miR-513b-5p 在IA 患者中的表達水平及其對人血管平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cells，HASMC）的可能調節機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2018-01—2020-01 于福建省立醫院診治的IA患者100例，其中男53例，女47例，年齡59（50～67）歲，均經數字減影血管造影確診IA。排除標準：（1）嚴重高血壓患者；（2）慢性腎臟病3期及以上者；（3）慢性肝炎、肝硬化等肝功能損傷患者；（4）凝血功能障礙者；（5）嚴重心肌病、心力衰竭、心律失常，或3個月內曾患心肌梗死者；（6）肌營養不良、重癥肌無力、肌炎等神經肌肉疾病患者；（7）甲狀腺功能亢進、糖尿病患者；（8）合并系統性感染，如肺炎、泌尿系感染者。同期選取100名無IA的志愿者為對照組，其中男57 例，女43 例，年齡60（53～66）歲。納入標準：（1）無IA家族史；（2）既往無蛛網膜下腔出血等顱內出血史；（3）顱腦磁共振檢查排除IA及蛛網膜下腔出血。本研究經院醫學倫理委員會批準（K2016-12-018）。

1.2 研究方法

1.2.1 血液指標檢測：檢測血液C 反應蛋白（CRP）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血漿總同型半胱氨酸（Hcy）、N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP）、肌酐水平。

1.2.2 血清hsa-miR-513b-5p、TNF-α和MMPs水平測定：采集IA組患者和對照組的靜脈血10 mL，分離并保存血清。取200 μL 血清通過NucleoZOL（美國Promega公司）提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒（美國Promega 公司）將1 μg RNA 逆轉錄合成互補DNA（cDNA）并行PCR擴增。使用引物序列（上海生工生物工程有限公司合成），以GAPDH（英國abcam公司）作為內參（表1）。采用定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）（試劑盒購自美國Promega 公司）測定血清hsa-miR-513b-5p、腫瘤壞死因子（TNF-α），以及基質金屬蛋白酶（MMPs）通路MMP2、MMP3、MMP9 和基質金屬蛋白酶抑制劑4（TIMP4）的表達水平。

表1 RT-qPCR所使用的基因序列Table 1 Gene sequence used in RT-qPCR

1.2.3 細胞培養和轉染及細胞增殖、凋亡和壞死檢測：用DMEM 培養基（美國Gibco 公司）培養HASMC（中國科學院生物化學與細胞生物學研究所），采用hsa-miR-513b-5p模擬物和抑制劑（福州載基生物科技有限公司），通過Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Invitrigen 公司）轉染HASMC，分為miR-513b-5p模擬物組和對照組、miR-513b-5p 抑制劑組及對照組，分析各組轉染效率。采用CCK-8試劑（上海碧云天生物科技有限公司）檢測各組HASMC細胞的增殖能力，AnnexinV Alexa Fluor 488/PI試劑（北京索萊寶科技有限公司）檢測細胞凋亡率，乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測細胞壞死。

1.2.4 miR-513b-5p 靶基因驗證和COL1A1 mRNA檢測：構建野生型和突變型重組雙熒光素酶報告載體，分別轉染miR-513b-5p 模擬物組及對照組HASMC，通過雙熒光素酶檢測試劑（美國Promega 公司）檢測熒光素酶活性，鑒定miR-513b-5p 靶基COL1A1，采用qRT-PCR測定各組COL1A1 mRNA表達水平。

1.2.5 蛋白含量檢測：采用BCA試劑（北京索萊寶科技有限公司）測定蛋白濃度，抗體孵育后（抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司及英國abcam 公司），使用ECL發光試劑（美國Thermo公司）顯影并成像，應用Image J軟件分析圖像。

1.3 統計學分析采用SPSS 20.0 軟件進行數據處理。服從正態分布的計量資料，以均值±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗；不服從正態分布的計量資料，以中位數和四分位間距（Q1～Q3）表示，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以頻數和百分比表示，兩兩比較采用卡方檢驗。采用GraphPad Prism 軟件進行統計分析并繪圖。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2 組臨床資料比較IA 組患者血HDL-C 高于對照組，而LDL-C、Hcy 和NT-proBNP 降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。2 組年齡、性別、CRP、TC、TG、HbA1c 和肌酐水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 IA組和對照組臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between intracranial aneurysm group and control group

2.2 血清hsa-miR-513b-5p、TNF-α 和MMPs 表達水平qRT-PCR 結果顯示，IA 組患者血清hsamiR-513b-5p 表達水平較對照組降低，而TNF-α 水平較對照組升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。此外，IA 組患者血清MMPs 通路相關基因MMP2、MMP3、MMP9水平高于對照組，而TIMP4水平低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 IA組和對照組各項指標比較Table 3 Comparison of various indexes between intracranial aneurysm group and control group

2.3 miR-513b-5p 模擬物和抑制劑轉染效率分析采用qRT-PCR 分析miR-513b-5p 轉染效率，結果顯示模擬物組（8.58±0.18）miR-513b-5p表達高于對照組（0.98±0.10），抑制劑組（0.35±0.05）miR-513b-5p表達低于對照組（1.04±0.02），差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 miR-513b-5p 對細胞增殖、凋亡和壞死的影響與模擬物對照組相比，miR-513b-5p 模擬物組細胞增殖能力降低，細胞凋亡率和壞死水平增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與抑制劑對照組相比，miR-513b-5p抑制劑組細胞增殖能力增強，而細胞凋亡率和壞死水平下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 轉染miR-513b-5p模擬物和抑制劑對HASMC增殖、凋亡和壞死的影響Table 4 Effect of transfection of miR-513b-5p mimics and inhibitors on the proliferation，apoptosis and necrosis of HASMC

2.5 miR-513b-5p 靶基因分析及雙熒光素酶活性檢測通過starbase數據庫預測發現COL1A1基因是miR-513b-5p的潛在靶基因。構建雙熒光素酶報告載體（圖1），雙熒光素酶檢測結果顯示共轉染COL1A1 3’UTR-WT 質粒和miR-513b-5p 模擬物的HASMC，其熒光素酶活性為（0.35±0.02）較轉染COL1A1 3’UTR-WT 質粒的模擬物對照組（0.94±0.17）降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；而共轉染COL1A1 3’UTR-Mut 質粒和miR-513b-5p 模擬物的HASMC，其熒光素酶活性為（1.00±0.10）與轉染COL1A1 3’UTR-Mut 質粒的模擬物對照組（0.91±0.08）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 miR-513b-5p 與COL1A1 3’-UTR的結合位點及突變形式Figure 1 The binding site and mutant form of hsa-miR-513b-5p and COL1A1 3’-UTR

2.6 miR-513b-5p 靶向抑制COL1A1 表達轉染miR-513b-5p 模擬物組（0.40±0.07）COL1A1 mRNA表達較模擬物對照組（1.10±0.21）降低，轉染miR-513b-5p 抑制劑組（2.45±0.30）COL1A1 mRNA 表達較抑制劑對照組（1.238±0.05）增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.7 miR-513b-5p靶向COL1A1調控RIP1-RIP3-MLKL 信號與模擬物對照組相比，miR-513b-5p模擬物組RIP1、p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL、caspase-8和p-caspase-8 蛋白表達增加，而miR-513b-5p 抑制劑組RIP1、p-RIP1、p-RIP3、p-MLKL、caspase-8 和p-caspase-8 蛋白表達較抑制劑對照組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 轉染miR-513b-5p模擬物和抑制劑對RIP1-RIP3-MLKL信號的影響Figure 2 Effect of transfection of miR-513b-5p mimics and inhibitors on RIP1-RIP3-MLKL signal

2.8 miR-513b-5p 靶向COL1A1 調控MMPs 信號與模擬物對照組相比，miR-513b-5p 模擬物組α-SMA、collagen 1、collagen 3 和TIMP4 蛋白表達降低，而MMP2、MMP3 和MMP9 蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。miR-513b-5p 抑制劑組α-SMA、collagen 1、collagen 3 和TIMP4 蛋白表達水平較抑制劑對照組升高，而MMP2、MMP3和MMP9蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 轉染miR-513b-5p模擬物和抑制劑對MMPs信號的影響Figure 3 Effect of transfection of miR-513b-5p mimics and inhibitors on MMPs signal

3 討論

最近研究表明，hsa-miR-513b-5p具有調節細胞生長、遷移和成熟的作用［19，22-23］，但hsa-miR-513b-5p是否在IA形成中的發揮作用尚無研究報道。本研究顯示，IA 患者血清中hsa-miR-513b-5p 表達水平顯著降低，其可能通過靶向抑制COL1A1 表達調節MMPs 和RIP1-RIP3-MLKL 途徑，誘導VSMC 增殖和細胞外基質合成，從而促進動脈瘤形成。VSMC是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞群，也是構成正常血管中膜的唯一細胞群，可通過表型轉化調節血管重塑過程。研究發現，在IA 中VSMC向內膜層、內彈力板和內皮細胞層遷移，其表型由收縮型轉變為合成型，從而增強平滑肌細胞增殖、遷移、合成和分泌細胞外基質蛋白的能力，發揮修復血管的作用［15］。

COL1A1 基因編碼膠原蛋白的α1 鏈，參與形成動脈壁中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原蛋白。細胞外基質中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白占全部膠原蛋白的90%，對維持血管壁彈性和抗牽拉性具有重要作用。細胞外基質重塑被認為是IA的典型病理特征之一，主要表現為細胞外基質成分和結構變化［24］。Ⅰ型膠原在IA 組織中大量形成，促進了動脈瘤壁持續性膠原重塑，尤其在易于破裂的動脈瘤組織中膠原重塑速度加快［25］。研究發現COL1A1在IA組織中顯著上調［26-27］。COL1A1 表達上調誘導細胞增殖和細胞外基質合成［18，28］。本研究顯示，抑制miR-513b-5p表達增加了COL1A1 表達，并促進α-SMA、TIMP4 和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達，減少MMP2、MMP3 和MMP9表達。α-SMA表達升高提示收縮型VSMC向合成型VSMC轉化，從而促進Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達。MMPs活化可酶解膠原蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白等，破壞細胞外基質結構。研究已證明MMP2、MMP2、MMP9 在IA 患者VSMC 中高表達，促進血管炎癥和膠原蛋白降解［21，29-31］。TIMP4 基因家族編碼基質金屬蛋白酶抑制劑在IA 中低表達［32］，TIMP4 表達降低導致MMPs尤其是MMP2和MMP9活性增加，導致細胞外基質重構失調，誘導IA 發展［33］。因此，miR-513b-5p表達降低，可促進VSMC表型轉化和細胞外基質沉積。

TNF-α在IA患者中顯著上調，可引起VSMC損傷壞死，致細胞外基質結構破壞、重塑、血管壁脆性增加、動脈壁向外擴張，促進IA形成，甚至破裂［34-37］。RIP1-RIP3-MLKL途徑已被確定為TNF-α啟動細胞壞死的決定因素［38］。主動脈瘤中RIP1、RIP3和MLKL水平升高，誘導VSMC壞死和細胞外基質降解，從而促進動脈瘤進程［39-41］。此外，動脈瘤平滑肌細胞RIP1高表達并與Caspase 8 結合形成復合物啟動細胞凋亡［40］。MLKL 通過與RIP3 相互作用，促進TNF 誘導的程序性細胞死亡過程。本研究表明，miR-513b-5p 上調TNF-α、RIP1、RIP3、MLKL和Caspase-8蛋白水平，促進VSMC 損傷壞死和凋亡，提示在動脈瘤中miR-513b-5p表達降低增強了VSMC活力和細胞外基質合成，導致血管壁重塑和彈性降低，易于受到血流沖擊。

hsa-miR-513b-5p 通過靶向抑制COL1A1 表達激活RIP1-RIP3-MLKL 和MMPs 途徑，從而抑制VSMC向合成型細胞表型轉化和細胞外基質合成，導致動脈瘤壁重塑和降解失調，影響IA發生、發展。